ALAS2通过抑制氧化应激改善铁死亡进而预防新生儿坏死性小肠结肠炎的机制研究

《MEDIATORS OF INFLAMMATION》：ALAS2 Prevents Neonatal Necrotizing Enterocolitis by Improving Ferroptosis in Intestinal Epithelial Cells Through Inhibition of Oxidative Stress

本文揭示了5′-氨基乙酰丙酸合酶2（ALAS2）在新生儿坏死性小肠结肠炎（NEC）中的关键保护作用。研究发现，NEC模型中ALAS2表达显著下调，导致肠道上皮细胞（IECs）内氧化应激（Fe2+/MDA升高、SOD降低）和铁死亡（ACSL4升高、FTH1降低）加剧。通过慢病毒过表达ALAS2可有效逆转上述损伤，减少细胞坏死22%，并调控营养代谢与氧化还原通路。该研究为NEC治疗提供了新的潜在靶点。

　　

引言

新生儿坏死性小肠结肠炎（NEC）是一种主要影响早产儿的毁灭性胃肠道急症，在极低出生体重儿中发病率达5%-10%，死亡率高达20%-30%。尽管新生儿护理水平不断提升，NEC仍是全球新生儿重症监护室发病和死亡的主要原因。该疾病以肠道炎症、屏障破坏和最终肠壁坏死为特征。NEC的发病机制涉及早产、肠道菌群失调、缺血再灌注损伤以及未成熟肠道内宿主免疫反应失调等多因素相互作用。这些损伤导致炎症级联反应的过度激活和氧化应激的产生，它们是肠道上皮细胞损伤和组织坏死进展的核心驱动因素。

炎症是NEC病理生理学的一个标志。促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素-γ（IFN-γ），在NEC中显著升高，它们在放大炎症反应和破坏肠道屏障方面起着关键作用。同时，氧化应激——由活性氧（ROS）的产生与抗氧化防御系统能力之间的失衡引起——是NEC发生的关键因素。早产儿的未成熟肠道由于抗氧化机制不完善，特别容易受到氧化损伤。氧化应激直接损害细胞组分，并与其他形式的调节性细胞死亡（RCD）密切相关。

在RCD通路中，铁死亡已成为多种胃肠道病理中的重要机制，包括炎症性肠病和缺血再灌注损伤。铁死亡是一种铁依赖性的RCD，由脂质过氧化物的积累驱动，这种积累源于细胞抗氧化防御系统的破坏和铁代谢的改变。蛋白质如长链脂酰辅酶A合成酶4（ACSL4）通过促进多不饱和脂肪酸掺入膜磷脂来促进铁死亡，而铁蛋白重链1（FTH1）通过螯合铁起到保护作用。总体而言，炎症和氧化应激的汇聚为IECs中的铁死亡创造了有利环境，这可能代表了NEC发病机制中一个关键但尚未被充分探索的轴心。

5′-氨基乙酰丙酸合酶2（ALAS2）是红系细胞中血红素合成通路的限速酶，对铁利用和血红蛋白产生至关重要。ALAS2活性影响细胞铁代谢和氧化还原稳态，这些过程与铁死亡易感性内在相关。然而，ALAS2在肠道炎症，特别是在NEC及其相关细胞死亡通路（如铁死亡）中的具体作用尚未被研究。通过分析GEO数据库（GSE64801、GSE193177和GSE198372）的原始数据，发现急性早产NEC患者和NEC模型新生小鼠的回肠组织中ALAS2表达显著下调。基于上述研究，有理由假设ALAS2可能参与NEC的进展，并且很可能与铁死亡相关。

本研究旨在体内外建立NEC模型，研究ALAS2对NEC的影响。研究发现ALAS2通过抑制IECs中的氧化应激和铁死亡来改善NEC。本研究结果可能为NEC治疗的理论基础提供有用信息。

材料与方法

动物模型

新生小鼠NEC模型的建立参照先前描述的方法并稍作调整。购买10周龄雌雄C57BL/6小鼠，自由交配受孕。在出生后第10天（P10），将新生小鼠随机分为两组：对照组和新生NEC组。对照组小鼠母乳喂养，不做任何干预。NEC组小鼠与母鼠分离，在28°C恒温箱中饲养。在出生后第10至14天（P10-14），通过口服灌胃每4小时给予配方奶30 μL/g体重，并每天两次对新生小鼠进行缺氧刺激（5%氧气和95%氮气）2分钟和冷刺激（4°C）10分钟。每天记录体重和生存状况。实验结束后，收集肠道组织用于后续实验。所有动物实验程序均经哈尔滨医科大学附属第六医院伦理委员会批准（批准号LC2024-078）。

细胞系与试剂盒

大鼠肠道上皮细胞IEC-6购自iCell Bioscience Technology Co., Ltd.。IEC-6细胞使用含10%胎牛血清、1%抗生素（20 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）和0.01 mg/mL胰岛素的DMEM培养基培养。细胞在37°C、5% CO₂的培养箱中维持。

慢病毒感染

将ALAS2编码序列插入慢病毒表达载体pLVX-IRES-puro的XhoI/NotI位点，然后与包膜质粒和包装质粒混合。使用Lipo 3000转染HEK293T细胞以产生慢病毒。IEC-6细胞接种于6孔板，当融合度达50%时，以50的感染复数（MOI）感染慢病毒，并在37°C、5% CO₂培养箱中继续培养。

组织学与分子生物学分析

采用苏木精-伊红（H&E）染色观察肠道组织病理学变化。通过免疫荧光检测ALAS2在肠道组织中的表达和定位。使用逆转录定量PCR（RT-qPCR）和蛋白质印迹（Western Blot）分别检测ALAS2、ACSL4和FTH1的mRNA和蛋白表达水平。通过相应试剂盒检测组织中Fe²⁺、丙二醛（MDA）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、过氧化氢酶（CAT）的活性。使用流式细胞术检测细胞坏死，CCK-8法检测细胞活力。采用C11 BODIPY 581/591荧光探针检测脂质ROS水平，JC-1染色检测线粒体膜电位变化。透射电子显微镜观察线粒体形态。

非靶向代谢组学分析

收集对照组和ALAS2过表达的细胞，进行非靶向代谢组学分析。采用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）评估样本分布。以变量投影重要度（VIP）>1和p < 0.05为标准筛选差异代谢物，并进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。

统计分析

所有实验数据以均值±标准差表示。使用GraphPad Prism 9.5软件进行数据分析。两组间差异显著性采用非配对t检验评估，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA）及Tukey事后检验。p < 0.05认为具有统计学意义。

结果

NEC相关差异表达基因分析

为了寻找新生儿NEC的有效生物标志物，从GEO数据库获取了正常和新生儿NEC组织的原始数据，并筛选了三个数据集（GSE64801、GSE193177和GSE198372）。进一步分析了三个NEC相关数据集中肠道组织的差异表达基因（DEGs），筛选标准为|log₂FC| > 1.5且调整后p < 0.05。热图显示了这些DEGs的分布。韦恩图分析表明，ALAS2是三个数据集共有的唯一下调基因。ALAS2在多种疾病中发挥作用，但其与NEC的关联尚未见报道。因此，选择ALAS2进行深入研究。

新生小鼠NEC模型的建立

成功建立了新生小鼠NEC模型。与对照组相比，NEC组小鼠体重显著下降，死亡率为20%。NEC组小鼠出现明显的肠道肿胀、肠气沉积和肠壁变薄。肠道组织外观评估显示NEC组肠腔扩张、肠壁颜色改变，而对照组未见明显肠道损伤。H&E染色显示，对照组肠道组织结构完整、排列有序，而NEC组肠道组织排列不规则、肌层变薄、坏死严重。NEC组肠道组织中TNF-α和IFN-γ含量也显著高于对照组。这些结果表明新生小鼠NEC模型建立成功。

NEC模型中ALAS2表达下调，氧化应激和铁死亡水平上调

评估了NEC模型中ALAS2的表达。与对照组相比，NEC组肠道组织中ALAS2 mRNA和蛋白相对表达量显著降低。免疫荧光检测也显示出类似结果。进一步检测了NEC组小鼠肠道组织中氧化应激和铁死亡水平的变化。与对照组相比，NEC组小鼠回肠组织中Fe²⁺和MDA水平升高，而SOD水平降低。透射电子显微镜下观察到NEC组线粒体出现明显的形态学变化，包括线粒体皱缩变小、基质密度增加、嵴减少。蛋白质印迹检测发现NEC组小鼠肠道组织中ACSL4表达升高，而FTH1表达受到抑制。综上所述，在NEC模型中，ALAS2表达下调，而氧化应激和铁死亡水平上调。

TNF-α和IFN-γ处理的IEC-6细胞中ALAS2表达

通过用TNF-α和IFN-γ诱导IEC-6细胞，进一步探讨了ALAS2在体外的表达和功能。流式细胞术检测不同时间点的细胞死亡情况，发现随着处理时间的延长，细胞坏死显著增加。此外，在细胞损伤过程中，ALAS2表达逐渐下调。这些数据表明，在TNF-α和IFN-γ诱导的IECs中ALAS2表达降低。

ALAS2抑制IEC-6细胞中的氧化应激和铁死亡水平

上述发现提示ALAS2可能在NEC进展中起重要作用。为验证这一假设，构建了ALAS2过表达的IEC-6细胞。转染ALAS2过表达慢病毒后，细胞中ALAS2表达显著增加。随后全面评估了ALAS2过表达对IEC-6细胞功能的影响。TNF-α和IFN-γ处理导致细胞死亡率增加、细胞活力抑制，但ALAS2过表达部分逆转了这些现象。此外，TNF-α和IFN-γ诱导细胞内Fe²⁺水平升高，提示细胞发生了铁死亡。通过BODIPY C11探针检测脂质ROS水平，发现TNF-α和IFN-γ暴露后细胞内脂质ROS水平升高。JC-1染色进一步观察到TNF-α和IFN-γ处理的细胞线粒体膜电位降低。然而，ALAS2过表达减弱了所有这些反应。随后通过试剂盒检测细胞中MDA含量，发现ALAS2过表达抑制了由TNF-α和IFN-γ处理引起的MDA水平升高。此外，暴露于TNF-α和IFN-γ后，抗氧化应激相关标志物（GSH、CAT和SOD）水平下调，但ALAS2过表达显著恢复了这些因子的表达。最后，通过蛋白质印迹检测各组细胞中ACSL4和FTH1的表达。与ACSL4不同，TNF-α和IFN-γ诱导的细胞中FTH1蛋白表达降低，但ALAS2过表达部分恢复了FTH1的表达。这些结果表明，ALAS2抑制了IEC-6细胞中的氧化应激和铁死亡水平。

ALAS2过表达IECs的非靶向代谢组学分析

为了进一步研究ALAS2在NEC进展中的作用机制，收集了对照组和ALAS2过表达的细胞，利用非靶向代谢组学探索ALAS2可能影响的代谢物。首先应用主成分分析（PCA）检查样本数据的整体分布，得分图显示样本分散在不同区域。此外，有监督的正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）进一步证明了对照组细胞和ALAS2过表达细胞之间具有良好的分离模式。然后以VIP > 1和p < 0.05为筛选标准筛选差异代谢物，热图揭示了对照组和ALAS2过表达组代谢物的明显不同模式。基于改变的代谢物进行的KEGG通路富集分析显示，约20条生物通路发生显著变化，主要涉及蛋白质消化吸收、嘧啶代谢、维生素消化吸收、癌症中的中央碳代谢、植物次级代谢产物的生物合成以及代谢通路。

讨论

尽管经过数十年研究，NEC的发病机制仍未完全明了。现有证据表明炎症、细菌感染、缺氧等多种因素之间存在复杂的相互作用，其中氧化应激是损伤的关键放大器。目前，NEC的可用治疗方案缺乏特异性靶点，主要集中于改善肠道环境。由于预防和治疗的局限性，NEC的死亡率长期未见显著改善。本研究首次发现ALAS2下调是NEC发病机制中一个未被认识的贡献者，从机制上将受损的血红素合成与氧化应激和铁死亡联系起来，这一发现具有重要的治疗意义。

炎症在NEC中的核心作用已得到充分证实。升高的TNF-α和IFN-γ通过调节紧密连接使上皮屏障破坏持续恶化，导致肠道屏障功能进一步恶化。与之前的报道一致，我们的NEC小鼠模型中TNF-α和IFN-γ等炎症因子水平显著升高。炎症介质与氧化应激协同作用，这对抗氧化防御系统不成熟的早产儿尤为有害。这些过程进一步导致蛋白质和细胞膜过氧化，以及过量MDA产生，造成细胞损伤。我们的数据证实了这种相互作用：NEC组织表现出典型的氧化损伤标志物（Fe²⁺/MDA升高，SOD降低）。关键的是，我们通过证明ALAS2恢复可正常化抗氧化能力（增加GSH/CAT/SOD），扩展了先前关于氧化还原失衡的观察，提示其在经典血红素合成功能之外还具有调节作用。

近年来，IECs过度死亡导致肠道屏障功能障碍的机制一直是NEC pathogenesis研究的热点。IECs是位于肠腔的连续单层细胞结构，细胞间紧密连接加固了肠道的物理屏障，是抵御环境和微生物攻击的第一道防线。铁死亡作为一种铁依赖性的RCD，已成为NEC中IEC死亡的关键介质。与凋亡或焦亡不同，铁死亡由脂质过氧化和线粒体功能障碍驱动，这些过程与氧化应激紧密相关。我们的发现与先前在NEC模型中观察到的游离铁和线粒体功能障碍的报告一致。在我们的NEC模型中，IECs表现出铁亡