《MEDIATORS OF INFLAMMATION》：Recombinant Thrombomodulin Domain 1 Promotes Diabetic Corneal Wound Healing by Inhibiting HMGB1 Production and NLRP3 Inflammasome
Abstract
本研究旨在探讨重组血栓调节蛋白第一结构域（rTMD1）在糖尿病角膜伤口愈合中的治疗潜力及其作用机制。研究采用毕赤酵母表达系统制备并纯化rTMD1蛋白，通过体外高糖（HG）环境下培养的人角膜上皮细胞（HCECs）划痕实验，以及链脲佐菌素（STZ）诱导的C57BL/6糖尿病小鼠角膜伤口模型，评估rTMD1对伤口愈合的促进作用。利用定量PCR（qPCR）、蛋白质印迹（Western blot）和免疫荧光染色等技术分析炎症标志物的表达。
研究结果显示，在体外实验中，rTMD1处理显著提高了高糖环境下HCECs的伤口愈合率（p= 0.0049）。在体内实验中，rTMD1治疗显著加速了糖尿病小鼠角膜伤口闭合，在24小时（p= 0.005）和48小时（p< 0.0001）时效果均优于PBS对照组。分子机制研究表明，rTMD1能够下调HMGB1、TLR4、NLRP3和IL-1β在mRNA和蛋白水平的表达，抑制NLRP3炎症小体介导的炎症反应。免疫荧光分析进一步证实，rTMD1治疗减少了糖尿病角膜中F4/80+巨噬细胞和NIMP-R14+中性粒细胞的浸润。
结论：局部应用rTMD1通过抑制HMGB1/TLR4/NLRP3信号通路介导的炎症反应，有效促进糖尿病条件下的角膜上皮伤口愈合。rTMD1有望成为治疗糖尿病角膜病变的潜在治疗药物，但其临床疗效和安全性尚需进一步研究验证。
1. 引言
糖尿病（DM）是一种常见的慢性代谢性疾病，其特征是长期高血糖和多种并发症，2021年全球患者约5.29亿。糖尿病角膜病变（DK）是糖尿病最常见的眼部并发症之一，在糖尿病患者中的患病率为47%–64%。DK临床表现为持续性角膜糜烂和溃疡，常伴有角膜敏感性降低，主要源于角膜伤口愈合受损和神经再生延迟。若处理不当，DK可进展为角膜穿孔和不可逆的视力丧失。当前的治疗策略侧重于控制血糖水平以及通过局部抗生素和润滑剂进行对症治疗，但这些方法疗效有限，因为它们未能解决糖尿病相关的角膜伤口愈合延迟的根本问题。
近年研究表明，过度炎症和感觉神经病变是导致DK的关键因素。适当的角膜伤口愈合需要炎症与再生之间的精细平衡。然而，在DK中，高血糖诱导的晚期糖基化终末产物（AGEs）和活性氧（ROS）积累通过损害细胞增殖、加剧炎症和增加细胞死亡来破坏这种平衡，最终导致伤口愈合延迟。此外，最新研究发现AGEs和ROS可激活NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体通路，导致白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-18（IL-18）产生增加，此级联反应促进细胞焦亡，进一步加重角膜伤口愈合障碍。
血栓调节蛋白（TM）是一种多功能跨膜糖蛋白，由五个不同的结构域组成：一个凝集素样结构域（D1）、一个包含六个表皮生长因子（EGF）样结构的结构域（D2）、一个富含丝氨酸和苏氨酸的结构域（D3）、一个跨膜结构域（D4）和一个胞质结构域（D5）。TM最初被鉴定为血管内皮细胞中具有抗凝血特性的凝血酶辅因子，现在日益认识到其抗炎功能，特别是其凝集素样结构域（TMD1）的作用。研究表明，TM可以隔离高迁移率族蛋白B1（HMGB1，一种损伤相关分子模式分子DAMP），从而减轻炎症反应。此外，研究证明TMD1可通过抑制核因子κB（NF-κB）/NLRP3炎症小体介导的炎症和细胞凋亡来缓解小鼠糖尿病肾病。在角膜中，我们前期的研究表明，TM在伤口愈合早期表达增加，并在伤口闭合后逐渐下降。此外，我们发现重组TM EGF样结构域加丝氨酸/苏氨酸丰富结构域（rTMD23）可有效促进角膜上皮伤口愈合。
鉴于其抗炎特性和促进皮肤伤口愈合的能力，TM，特别是其凝集素样结构域（TMD1），有潜力成为DK的治疗药物。然而，TMD1对糖尿病角膜伤口愈合的影响及其潜在机制尚不清楚。因此，本研究旨在利用原代人角膜上皮细胞（HCECs）和动物模型探讨重组TMD1（rTMD1）在糖尿病角膜伤口愈合中的治疗潜力。
2. 材料与方法
2.1. rTMD1蛋白的制备
rTMD1蛋白使用毕赤酵母表达系统制备，随后通过镍螯合琼脂糖柱进行纯化。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）评估所得rTMD1蛋白的纯度。
2.2. 糖尿病动物模型
本研究使用7-9周龄雄性C57BL/6小鼠。通过连续五天腹腔注射链脲佐菌素（STZ，50 mg/kg）诱导1型糖尿病。最后一次STZ注射后2周，使用血糖仪测量血清葡萄糖水平。血清葡萄糖水平超过250 mg/dL的小鼠被归类为糖尿病小鼠。
2.3. 体内角膜上皮伤口愈合与治疗
在手术前，正常和糖尿病小鼠通过腹腔注射 Zoletil（50 mg/kg）联合 Xylazine（2.5 mg/kg）进行麻醉。此外，角膜局部滴注0.5%丙美卡因盐酸盐进行麻醉。使用2毫米活检穿孔器划定一眼中央角膜区域，然后使用Algerbrush II角膜锈环去除器轻柔去除中央角膜上皮，创建标准化伤口。在清创术后立即（0时）和术后24小时两次进行局部治疗。糖尿病治疗组（DM-rTMD1）每次滴加5 μL浓度为2 mg/mL的rTMD1 PBS溶液（10 μg/次；总剂量20 μg/眼）。对照组（正常-PBS和DM-PBS）在相同时间点滴加5 μL PBS。使用荧光素染色监测角膜伤口愈合，并在0、24和48小时使用裂隙灯显微镜拍摄残留上皮缺损照片。使用ImageJ软件量化伤口愈合面积以确定伤口闭合百分比。48小时后，按照AVMA指南，以30%腔体体积/分钟的流速通过渐进填充二氧化碳（CO2）吸入法处死小鼠。随后收集角膜标本进行免疫荧光染色。
2.4. 细胞培养
从公司购买原代人角膜上皮细胞（HCECs），并在添加了EGF、氢化可的松和胎牛血清（FBS）的人上皮细胞培养基中培养。为建立正常和高糖（HG）条件，将细胞接种到六孔板中，并在含有5 mM葡萄糖（正常葡萄糖，NG）或30 mM葡萄糖（HG）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养48小时。细胞汇合后，使用200 μL移液器吸头创建划痕。然后将细胞在NG培养基、HG培养基或补充了20 nM TMD1的HG培养基中培养24小时。在划痕后0和24小时拍摄图像，并使用ImageJ软件分析伤口闭合百分比。
2.5. 实时定量PCR（qPCR）
使用Real Genomics总RNA提取试剂盒从HCECs中提取总RNA。使用PowerUp SYBR Green Master Mix进行qPCR。本研究中使用的引物列于表1。
2.6. 蛋白质印迹分析
使用放射免疫沉淀测定（RIPA）缓冲液从HCECs中提取总蛋白。大约20 μg总蛋白在10% SDS-PAGE凝胶上分离，随后转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。膜在室温下用1%牛血清白蛋白（BSA）封闭1小时，然后在4°C下与针对HMGB1、TLR4、NLRP3、IL-1β和GAPDH的一抗孵育过夜。孵育后，在室温下应用物种特异性二抗1小时。使用增强化学发光（ECL）试剂显示蛋白信号，并使用Amersham Imager 600捕获。使用ImageJ软件量化条带强度。
2.7. 免疫荧光染色
收集角膜样本，固定并石蜡包埋，然后切片厚度为5 μm。经过脱蜡、水化和抗原修复后，切片用0.1% Triton X-100透化，并在室温下用5%山羊血清封闭1小时。然后将切片在4°C下与针对HMGB1、TLR4、NLRP3、IL-1β、F4/80和NIMP-R14的一抗孵育过夜。洗涤后，切片在室温下与Alexa Fluor 488或546标记的抗兔IgG孵育1小时，细胞核用DAPI复染。通过省略一抗并在相同成像设置下仅与二抗孵育来处理阴性对照。
对于定量分析，在所有组相同的显微镜设置下捕获免疫荧光图像。每个切片随机选择三个不重叠的高倍视野（HPF）。联合评估上皮和基质区域进行量化。对于HMGB1、TLR4、NLRP3和IL-1β，使用ImageJ通过勾画感兴趣区域并减去阴性对照切片的背景信号来测量每个HPF的平均荧光强度（MFI）。对于F4/80和NIMP-R14，手动计数每个HPF的阳性染色细胞。对所有组的值进行统计学比较以评估相对表达水平。
2.8. 统计分析
所有数据表示为平均值±标准差（SD）。两组比较使用非配对双尾Student t检验，三组及以上比较使用单因素方差分析（ANOVA），统计学显著性设定为p< 0.05。所有统计分析均使用Prism 8.0软件进行。
3. 结果
3.1. rTMD1在高糖条件下促进HCECs伤口愈合
为确定rTMD1是否在高糖条件下促进角膜伤口愈合，我们建立了使用原代HCECs的划痕损伤模型。细胞在用移液器吸头诱导损伤后，在NG培养基、HG培养基或补充了rTMD1（20 nM）的HG培养基中培养。损伤后24小时，NG组、HG组和HG + rTMD1组的平均伤口愈合百分比分别为60.25%、41.93%和63.23%。与NG组相比，HG组的伤口愈合率显著降低（n= 5; p= 0.0281），而HG + rTMD1组与HG组相比显示出显著更高的伤口愈合率（n= 5; p= 0.0049）。这些发现表明高糖环境损害人角膜上皮伤口愈合，而rTMD1在高糖条件下增强愈合过程。
3.2. rTMD1在HCECs中抑制HMGB1产生和NLRP3炎症小体介导的炎症
既往研究表明TMD1通过NLRP3通路减轻糖尿病肾病的炎症。为探索rTMD1促进糖尿病条件下角膜伤口愈合的潜在机制，我们在损伤后24小时使用qPCR和蛋白质印迹法分析了HCECs中的mRNA和总蛋白水平。与NG组相比，HG组中HMGB1、TLR4、NLRP3和IL-1β的mRNA表达水平显著更高（HMGB1: p= 0.038, n= 5; TLR4: p= 0.0043, n= 6; NLRP3: p= 0.0002, n= 5; IL-1β: p= 0.0041, n= 6），表明HG条件促进炎症。然而，与HG组相比，rTMD1处理显著降低了HG + rTMD1组中这些炎症标志物的mRNA表达（HMGB1: p= 0.0363, n= 5; TLR4: p= 0.0372, n= 6; NLRP3: p= 0.0128, n= 5; IL-1β: p= 0.0126, n= 6）。
类似地，蛋白质印迹分析显示，与HG组相比，HG + rTMD1组中HMGB1、TLR4、NLRP3和IL-1β的蛋白水平显著降低（HMGB1: p= 0.0083, n= 3; TLR4: p= 0.0418, n= 4; NLRP3: p= 0.0401, n= 4; IL-1β: p= 0.0383, n= 3）。这些发现表明rTMD1通过抑制HMGB1产生和TLR4/NLRP3/IL-1β信号通路来减轻炎症，这可能有助于改善糖尿病条件下的角膜伤口愈合。
3.3. rTMD1促进STZ诱导的糖尿病小鼠的角膜伤口愈合
为研究rTMD1在体内糖尿病角膜伤口愈合中的治疗潜力，我们首先通过腹腔注射STZ在C57BL/6小鼠中诱导1型糖尿病。本研究共使用30只小鼠，计划每组10只。在20只接受STZ诱导糖尿病的小鼠中，有6只未达到高血糖阈值被排除，最终14只糖尿病小鼠用于分析。随后在中央角膜创建2毫米直径的伤口。正常对照小鼠接受5 μL PBS，而糖尿病小鼠接受5 μL PBS（DM-PBS组）或rTMD1（DM-D1组）。荧光素染色显示，在损伤后24小时（n= 7; DM-PBS: 90.8 ± 5.3% vs. 正常-PBS: 81.0 ± 8.4%; p= 0.0235）和48小时（n= 7; DM-PBS: 80.4 ± 13.6% vs. 正常-PBS: 32.0 ± 20.6%; p= 0.0002），DM-PBS组的残留角膜缺损面积显著大于正常对照组。相比之下，DM-D1组在24小时（n= 7; 73.9 ± 12.0% vs. 90.8 ± 5.3%; p= 0.005）和48小时（n= 7; 28.5 ± 11.3% vs. 80.4 ± 13.6%; p< 0.0001）显示的缺损面积显著小于DM-PBS组。这些发现表明rTMD1促进糖尿病小鼠的角膜上皮伤口愈合。
3.4. rTMD1减少STZ诱导的糖尿病小鼠的白细胞浸润、HMGB1表达并抑制NLRP3炎症小体相关炎症
为在体内进一步阐明rTMD1的抗炎作用，我们使用针对F4/80和NIMP-R14的免疫荧光染色检查了糖尿病小鼠角膜中的白细胞浸润。与正常-PBS组相比，DM-PBS组的角膜显示出F4/80+巨噬细胞和NIMP-R14+中性粒细胞数量显著增加，表明糖尿病条件下炎症细胞浸润增强。值得注意的是，rTMD1治疗显著减少了DM-D1组中这两种细胞类型的存在，表明rTMD1减弱了糖尿病角膜中的炎症细胞募集。
此外，我们使用针对HMGB1、TLR4、NLRP3和IL-1β的免疫荧光染色评估了正常-PBS、DM-PBS和DM-D1组角膜切片中关键炎症介质的表达。与正常对照组相比，DM-PBS组的糖尿病角膜对所有四种标志物显示出更高的免疫反应性。相比之下，rTMD1治疗的糖尿病角膜对HMGB1、TLR4、NLRP3和IL-1β的荧光强度显著降低。这些发现表明rTMD1通过抑制白细胞浸润和下调整HMGB1/TLR4/NLRP3/IL-1β介导的炎症来促进糖尿病角膜伤口愈合。
4. 讨论
DK是糖尿病常见的眼部并发症，影响角膜，导致伤口愈合延迟和神经支配受损。尽管越来越多的证据表明高血糖诱导的过度炎症和神经病变是导致DK的关键因素，但其完整发病机制和有效治疗选择仍不清楚。在本研究中，我们证明rTMD1在体外和体内糖尿病模型中抑制HMGB1/TLR4/NLRP3介导的炎症并加速角膜伤口愈合。这些发现表明rTMD1有潜力成为DK的潜在治疗选择。
TMD1是TM的凝集素样结构域，已证明具有抗炎和抗血管生成特性，这在糖尿病肾病和氧诱导的视网膜病变等疾病中有益。这些特性使TMD1特别适合治疗DK。因此，在本研究中，我们建立了体外和体内模型来研究rTMD1在糖尿病角膜伤口愈合中的治疗潜力和机制。在我们的HCECs划痕损伤模型中，HG环境显著损害伤口愈合，而rTMD1治疗有效提高了愈合率。类似地，在STZ诱导的糖尿病小鼠中，局部使用rTMD1治疗的小鼠与PBS治疗组相比表现出显著更快的伤口闭合。重要的是，rTMD1治疗后未观察到角膜新生血管，进一步支持其适用于角膜治疗。这些结果共同表明rTMD1在糖尿病条件下有效增强角膜伤口愈合。
使用蛋白质印迹和qPCR进行的分子分析在我们的体外模型中显示，与NG对照组相比，HG条件显著上调了HMGB1、TLR4、NLRP3和IL-1β的表达。rTMD1处理显著降低了这些炎症标志物的表达。一致地，我们体内模型中的免疫荧光染色证实rTMD1有效抑制了HMGB1、TLR4、NLRP3和IL-1β的表达，突出了其在糖尿病角膜中的抗炎作用。除了抑制炎症信号外，rTMD1还减少了糖尿病角膜中的免疫细胞浸润。具体而言，免疫荧光分析显示rTMD1显著减少了F4/80+巨噬细胞和NIMP-R14+中性粒细胞的存在，进一步支持其在高糖条件下减轻角膜炎症的作用。
HMGB1是一种典型的DAMP，它与TLR4结合激活NF-κB并启动NLRP3炎症小体，从而放大IL-1β驱动的炎症；糖尿病相关的AGEs和ROS进一步增强NLRP3激活和细胞焦亡，延迟上皮修复。在我们的模型中，rTMD1降低了HMGB1、TLR4、NLRP3和IL-1β，同时降低了角膜F4/80+巨噬细胞和NIMP-R14+中性粒细胞，表明广泛抑制了炎症环境。通过限制这种过度炎症反应，rTMD1可能促进更有利于炎症消退和组织修复的环境。从机制上讲，TM的凝集素样结构域直接隔离细胞外HMGB1，限制其刺激模式识别受体的可用性，从而减弱下游信号传导。同时，D1通过结合Lewis-Y决定簇中和脂多糖（LPS），从而削弱TLR4依赖性激活并减少粘附分子和细胞因子的诱导。在糖尿病组织中，D1还增强NRF2相关的抗氧化防御，同时限制NF-κB/NLRP3信号传导和细胞凋亡，这为我们在高糖应激下的发现提供了机制桥梁。尽管我们没有测量切割的caspase-1、切割的或分泌的IL-1β，但先前的糖尿病模型显示D1降低了caspase-1活性，降低了全身IL-1β和IL-18水平，并且在高糖条件下降低了细胞HMGB1。这些发现与我们观察到的HMGB1、TLR4、NLRP3和IL-1β抑制一致，并支持rTMD1作为炎症小体启动和激活的抑制剂。
除了细胞外隔离，我们的数据表明rTMD1也可能在转录水平抑制HMGB1的产生。在我们的模型中，rTMD1治疗显著降低了HMGB1 mRNA表达，表明在蛋白释放上游存在调节效应。一种可能的解释是，角膜炎症的减轻，如巨噬细胞和中性粒细胞浸润减少所示，导致HMGB1合成和主动分泌减少。先前研究表明TMD1减弱NF-κB激活，这是控制炎症条件下HMGB1表达和释放的关键通路。这种反馈机制可能有助于rTMD1在糖尿病角膜损伤中更广泛的抗炎和修复作用。
来自非糖尿病角膜损伤的证据进一步支持rTMD1的多节点作用：在碱烧伤模型中，它促进上皮恢复，将巨噬细胞极化从促炎M1（CD86）转向修复性M2（CD206），并抑制ERK/HIF-1α及其下游的VEGF和TNF-α减少，这些变化有利于炎症消退和组织修复。尽管尚未定义rTMD1的专用跨膜受体，但HMGB1隔离和LPS中和的结合，加上对ERK/HIF-1α–VEGF、NF-κB和NRF2通路的调节，为本文观察到的炎症信号广泛减弱提供了一致的解释。关于增殖效应，我们的研究没有直接量化上皮增殖；然而，我们前期的研究表明rTMD1在抑制致病性ERK/HIF-1α活性的同时保持细胞活力/增殖，这表明糖尿病中加速的闭合可能反映了炎症障碍的解除和修复能力的维持，而不是非选择性的有丝分裂刺激。总之，这些数据表明rTMD1赋予了一般的抗炎、促修复益处，并且在糖尿病角膜中，特异性纠正了对高血糖敏感的HMGB1/TLR4/NLRP3信号以促进上皮再生。
本研究在转化方面存在几个局限性。首先，体外HCEC测定和STZ诱导的小鼠模型不能完全重现人类DK的慢性、多因素性质。更大的转化相关性需要在人类糖尿病角膜组织以及更接近人类眼部解剖结构、愈合动力学和神经支配的更大糖尿病动物模型中进行评估。其次，尽管rTMD1在高糖条件下加速了上皮再生，但我们的终点主要捕获了伤口闭合；需要分别量化上皮增殖和迁移以及评估角膜神经支配和感觉功能的研究。第三，我们在体外使用了单一浓度，在体内使用了单一的局部给药方案。剂量反应关系、制剂优化以及在角膜表面的停留时间仍有待确定。第四，我们没有进行专门的眼部生物安全性测试。先前的证据支持rTMD1的耐受性：在氧诱导的视网膜病变模型中，rTMD1未诱导细胞毒性并抑制了细胞凋亡，并且单独的角膜研究已应用2 mg/mL的局部rTMD1而未报告安全性信号。然而，局部rTMD1的正式临床前计划仍然是必需的，包括标准化的角膜毒性和刺激性测定。最后，机制分析集中于HMGB1/TLR4/NLRP3轴。其他通路可能也参与其中，包括ERK和HIF-1α调节、巨噬细胞极化和NRF2依赖性抗氧化反应。明确的因果关系需要在糖尿病角膜系统中进行靶向扰动和通路水平验证。
总之，我们的研究表明局部应用rTMD1通过抑制HMGB1/TLR4/NLRP3/IL-1β介导的炎症来增强糖尿病角膜伤口愈合。这些发现强调了rTMD1作为管理DK的有前景治疗方法的潜力。需要进一步的研究来验证这些发现并探索rTMD1在临床环境中的更广泛治疗意义。
