《MEDIATORS OF INFLAMMATION》：Sirtuin 4 Knockout Aggravates Sepsis-Induced Acute Liver Injury by Enhancing Mitochondrial Fission and Mitophagy in Hepatocytes
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本研究揭示了Sirtuin 4（Sirt4）在脓毒症诱导的急性肝损伤（SALI）中的关键保护作用。通过盲肠结扎穿刺（CLP）小鼠模型和LPS处理的AML12细胞实验，发现Sirt4敲除（KO）会通过增强线粒体分裂（DRP1/MFF↑）和线粒体自噬（PINK1/Parkin/LC3B↑）加重肝损伤，而Sirt4过表达（OE）则能通过抑制线粒体动力学失衡和过度线粒体自噬发挥保护作用。研究首次阐明Sirt4-DRP1-线粒体自噬轴是脓毒症肝损伤的核心调控机制，为靶向Sirt4的治疗策略提供了理论依据。
1. 引言
脓毒症作为一种由感染引起的宿主反应失调导致的危及生命的器官功能障碍，是重症监护病房患者死亡的主要原因之一。其病理过程始于病原体入侵引发的过度全身炎症反应（即"细胞因子风暴"），进而进展为免疫抑制、代谢紊乱和持续性多器官功能障碍综合征（MODS），死亡率居高不下。在MODS中，肝损伤占据核心地位。作为人体的代谢和免疫中心，肝脏在脓毒症中极易受损，其功能障碍会进一步加剧整体病情的恶化，形成恶性循环。脓毒症诱导的急性肝损伤（SALI）严重破坏代谢稳态的稳定性，削弱清除病原体的能力，预示着不良的临床预后。因此，阐明脓毒症肝损伤的分子机制对于制定新的治疗策略至关重要。
线粒体作为细胞的能量工厂和凋亡、炎症信号的整合中心，在脓毒症的功能稳态中扮演双重角色。适度的线粒体自噬（mitophagy）是清除受损线粒体、维持细胞健康的保护机制，然而过度或失控的线粒体自噬会导致细胞能量耗竭和死亡。线粒体动力学（融合与分裂）的平衡是维持其功能的基础，过度分裂常与细胞损伤相关。Sirtuin 4（Sirt4）是一种位于线粒体的NAD+依赖性脱乙酰酶，近年来被发现其在能量代谢和应激反应中起关键作用。然而，Sirt4在脓毒症这一重大应激模型中的作用，尤其是在关键器官肝脏中的功能研究甚少。其是否通过调控线粒体质量控制在脓毒症肝损伤中发挥作用尚属未知。基于Sirt4的线粒体定位及其在应激反应中的新兴作用，本研究提出科学假设：Sirt4可能通过调控线粒体自噬和动力学平衡在脓毒症肝损伤中发挥重要的保护作用。
2. 方法
本研究通过盲肠结扎穿刺（CLP）手术建立脓毒症小鼠模型，比较野生型（WT）和Sirt4基因全身性敲除（Sirt4-KO）小鼠的肝损伤程度。采用血清天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和组织学分析评估肝损伤；通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清白细胞介素-6（IL-6）水平；采用蛋白质印迹（Western blotting）、免疫组织化学染色、免疫荧光染色、透射电子显微镜（TEM）观察线粒体形态、线粒体膜电位（JC-1染色）、细胞凋亡（流式细胞术、TUNEL染色）等技术检测线粒体自噬和线粒体动力学指标。体外实验使用小鼠肝细胞系AML12，通过LPS刺激模拟脓毒症诱导的肝损伤，并利用小干扰RNA（siRNA）敲低Sirt4或质粒过表达Sirt4进行功能验证。使用DRP1抑制剂Mdivi-1处理细胞，探讨其干预作用。
3. 结果
3.1. Sirt4在CLP处理的小鼠肝脏和LPS处理的AML12细胞中表达下调
免疫组化染色和蛋白质印迹结果显示，与假手术（SHAM）组相比，CLP模型小鼠肝组织中Sirt4的表达显著下调。体外实验中，LPS刺激AML12细胞后，Sirt4蛋白水平也呈浓度依赖性下降。
3.2. Sirt4敲除加重CLP诱导的急性肝损伤
与WT小鼠相比，Sirt4-KO小鼠在CLP术后表现出更严重的肝功能障碍，血清AST、ALT和IL-6水平显著升高。肝组织H&E染色显示Sirt4-KO CLP小鼠有更严重的组织学评分，表现为坏死、血栓形成和炎性细胞浸润。免疫组化显示肝组织肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达增加，TUNEL染色显示肝细胞凋亡加剧。
3.3. Sirt4敲除通过促进线粒体动力学失衡和线粒体自噬加剧肝细胞线粒体损伤
透射电镜显示Sirt4-KO小鼠肝细胞线粒体嵴减少、分裂增加。免疫组化和蛋白质印迹表明，与CLP组相比，Sirt4-KO CLP组小鼠肝组织中线粒体自噬标志物Parkin和LC3B的表达上调。同时，线粒体分裂相关蛋白DRP1和MFF表达增加，而融合相关蛋白MFN1表达下降。体外实验在AML12细胞中敲低Sirt4并给予LPS刺激，得到了与体内实验一致的结果。
3.4. Sirt4过表达减轻CLP诱导的急性肝损伤
通过尾静脉注射携带Sirt4过表达载体的肝靶向AAV8病毒，在体过表达Sirt4。结果显示，Sirt4-OE显著改善了CLP引起的小鼠血清AST、ALT、IL-6升高，减轻了肝组织病理损伤、TNF-α表达和肝细胞凋亡。
3.5. Sirt4过表达通过抑制线粒体动力学失衡和线粒体自噬减轻肝细胞线粒体损伤
在Sirt4-OE的CLP小鼠肝脏中，线粒体嵴结构得到改善，Parkin表达降低。蛋白质印迹显示Sirt4-OE抑制了线粒体自噬（Parkin, LC3B）和线粒体分裂（DRP1, MFF），并促进了线粒体融合（MFN1）。体外过表达Sirt4同样逆转了LPS引起的AML12细胞线粒体动力学失衡和过度线粒体自噬。
3.6. DRP1抑制剂Mdivi-1抑制Sirt4缺失引起的肝细胞损伤和线粒体损伤
在敲低Sirt4的AML12细胞中，使用DRP1抑制剂Mdivi-1处理。结果显示，Mdivi-1减轻了LPS+siSirt4引起的细胞凋亡，改善了线粒体膜电位，并抑制了过度活化的线粒体自噬和线粒体分裂。
4. 讨论
本研究主要发现包括：首先，在CLP诱导的脓毒症模型中，小鼠肝脏Sirt4表达下调。其次，Sirt4基因敲除小鼠表现出比WT小鼠更严重的肝损伤和全身炎症反应。Sirt4缺失通过破坏线粒体稳态，具体表现为过度激活的线粒体自噬和失衡的线粒体动力学（倾向于分裂），最终导致更严重的肝细胞损伤。机制上，Sirt4通过抑制脓毒症诱导的肝细胞线粒体分裂来调节线粒体自噬。这一发现不仅确立了Sirt4在脓毒症肝脏保护中的关键地位，更重要的是直接将Sirt4与线粒体质量控制的核心病理过程联系起来，为脓毒症肝损伤的临床治疗提供了有前景的新视角。
本研究与Sirt4作为细胞应激监护者的新兴作用高度一致。Sirt4敲除小鼠在CLP术后表现出更高水平的血清AST/ALT、更严重的肝组织结构损伤和更高的促炎因子IL-6浓度，表明内源性Sirt4是对抗脓毒症肝损伤的重要分子屏障。肝脏在脓毒症的"免疫-代谢"交互对话中处于核心地位，Sirt4缺失可能同时破坏这两方面的稳态。
本研究最关键的贡献在于揭示了Sirt4与脓毒症中线粒体质量控制之间的精确机制关联。研究者提出Sirt4是线粒体自噬的"校准器"或"刹车"。在WT小鼠中，Sirt4的正常表达可能通过其ADP-核糖基转移酶活性修饰线粒体自噬通路中的关键蛋白，从而将自噬流限制在适度、可控、有益的水平。Sirt4缺失导致线粒体动力学失衡，表现为线粒体碎片化加剧，这通常由过度增加的线粒体分裂蛋白DRP1和减少的融合因子MFN1引起。碎片化的线粒体不仅产能低下且更不稳定，更容易发生膜电位崩溃，成为线粒体自噬的靶标。值得注意的是，线粒体动力学与线粒体自噬之间存在密切对话：MFF介导的分裂是启动线粒体自噬的前提，持续分裂促进广泛的线粒体自噬。因此，在Sirt4-KO小鼠肝脏中观察到的过度线粒体自噬和线粒体碎片化很可能是同一问题的两个方面，形成正反馈循环，相互加剧，共同将肝细胞推向死亡。
Sirt4同时调控这两个过程的机制尚未完全揭示。可能通过修饰DRP1抑制其GTP酶活性或线粒体募集，同时通过修饰OPA1促进融合来协调整个线粒体网络的重塑。另一种可能是Sirt4通过调控共同的上游信号，如细胞能量状态（AMPK/ATP）或氧化应激水平来整合代谢信号。未来研究的重点将是精确鉴定Sirt4在肝脏中的酶活性底物。
本研究结果具有深远的转化医学意义。目前脓毒症的治疗仍主要侧重于抗感染和支持治疗，缺乏直接针对器官损伤的特异性药物。该研究将Sirt4推向了舞台中央，成为一个极具前景的新型治疗靶点。理论上，通过小分子药物激活Sirt4活性，可能校准脓毒症中失控的线粒体自噬，使其恢复至保护性水平，并稳定动力学平衡，从而保护肝细胞乃至其他器官细胞免受损伤，改善患者预后。
结论
本研究不仅确立了Sirt4在脓毒症急性肝损伤中不可或缺的作用，而且揭示了一种通过抑制由线粒体动力学失衡（包括线粒体分裂增加和融合减少）诱导的线粒体自噬的保护机制。研究结果描绘了一条全新的Sirt4-DRP1-线粒体自噬轴作为脓毒症肝损伤的关键调控机制，提示Sirt4是一个潜在的治疗靶点。
