《International Journal of Genomics》：Single-Cell RNA-seq Reveals Deubiquitination Genes as Prognostic Markers in Hepatocellular Carcinoma
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本研究通过整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）与批量RNA测序数据，系统分析了去泛素化（DUB）基因在肝细胞癌（HCC）中的表达模式及其临床意义。研究发现，DUB高活性肿瘤细胞表现出增强的炎症反应、IFN-γ信号通路及免疫细胞浸润特征，并构建了基于78个DUB相关基因的预后模型（DAS），该模型在TCGA和ICGC队列中均显示出优异的生存预测能力（1年、3年AUC>0.9），为HCC患者风险分层和个性化治疗提供了新策略。
摘要
背景
肝细胞癌（HCC）预后较差，而去泛素化（DUB）作为重要的翻译后调控机制，其在HCC进展中的作用尚不明确。
方法
研究整合了13例初治HCC肿瘤的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，以及374例TCGA和243例ICGC批量RNA测序队列。采用AUCell量化每个细胞的去泛素化酶（DUB）活性，利用clusterProfiler进行通路富集分析。通过LASSO-Cox机器学习流程构建基于DUB的风险特征，并借助时间依赖性ROC分析进行内部和外部交叉验证。
结果
恶性细胞相对于免疫区室（髓系细胞、B细胞）表现出差异化的DUB转录。DUB高活性肿瘤亚群显示炎症和IFN-γ信号通路增强，与活跃的免疫浸润一致。基于78个基因的预后指数在发现队列和验证队列中均能有效分层患者生存。
结论
本研究揭示了去泛素化在HCC进展中的作用及其作为预后生物标志物的潜力。开发的模型可作为患者分层和个性化治疗策略的有价值工具，但需进一步实验验证确认这些发现。
1. 引言
肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的第二大原因，治疗选择有限且预后较差。HCC的高度异质性给治疗开发和临床结果预测带来挑战。泛素化是一种重要的翻译后修饰，调控蛋白质周转和细胞代谢，而去泛素化（DUB）则通过去除底物蛋白的泛素链维持蛋白质稳态。泛素化与DUB之间的平衡失调与包括HCC在内的多种肿瘤的发生发展密切相关。尽管泛素化在HCC中已得到广泛研究，但DUB的作用、机制及临床意义仍待深入探索。单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的进步为在单细胞水平解析HCC分子机制提供了新机遇。本研究聚焦DUB相关基因在HCC中的作用，旨在阐明其在肿瘤发生发展中的具体贡献，并通过生物信息学分析识别潜在的生物标志物，以改善HCC患者的预后预测和指导治疗策略。
2. 方法
2.1. scRNA-seq数据的获取与处理
研究整合了13例HCC样本的scRNA-seq数据，使用Seurat R包进行数据处理和细胞聚类。采用Harmony R包校正批次效应，并通过一系列Seurat流程（NormalizeData, FindVariableFeatures, ScaleData, RunPCA, FindNeighbors, FindClusters, RunUMAP）实现细胞亚群的精确聚类和分子表征。使用AUCell计算单细胞水平的DUB活性，依据中位值将细胞分为高评分组和低评分组。
2.2. 批量RNA测序数据分析
从TCGA和ICGC数据库获取HCC患者的转录组数据，使用sva R包的ComBat函数校正批次效应。采用基因集变异分析（GSVA）进行通路富集分析，从MSigDB数据库获取高质量基因集。DUB相关基因从GeneCards数据库检索并基于相关性评分编译。
2.3. 预后模型构建
首先进行单变量Cox回归分析识别与患者生存相关的关键基因。采用10折交叉验证策略评估101种机器学习算法组合，包括逐步Cox回归、Lasso、Ridge、偏最小二乘Cox回归（plsRcox）、CoxBoost、随机生存森林（RSF）、梯度提升机（GBM）、弹性网络（Enet）、监督主成分（SuperPC）和生存支持向量机（survival-SVM）。选择一致性指数（C-index）最高的模型作为最佳预后工具，并通过ROC曲线分析和PCA验证模型预测性能。
2.4. 统计分析
所有数据分析使用R软件（版本4.2.0）进行。采用Kaplan-Meier生存分析和log-rank检验评估生存差异。连续变量比较使用t检验或Wilcoxon秩和检验，分类变量使用卡方检验或Fisher精确检验。应用错误发现率（FDR）校正控制多重检验误差，Pearson相关分析评估变量间关系。
3. 结果
3.1. 样本整合、细胞聚类与注释
研究整合了13例人HCC scRNA-seq样本，通过Harmony整合后获得统一数据集。Seurat识别出19个 distinct 细胞簇，通过16个常见标记基因（EPCAM, PECAM1, VWF, COL1A1, ACTA2, LYZ, CD68, KIT, MS4A2, NKG7, NCR1, MS4A1, CD79A, CD3E, CD8A, FOXP3）表达谱进行细胞类型注释。最终将细胞簇分类为HCC细胞、髓系细胞、NK/T细胞、成纤维细胞、内皮细胞、B细胞和肥大细胞。
3.2. DUB基因活性评分
从GeneCards数据库筛选245个DUB基因，使用AUCell计算活性评分。依据中位评分将细胞分为高评分组和低评分组。DUB高评分细胞主要富集在HCC细胞和髓系细胞中，而低评分细胞主要见于B细胞。其他细胞类型呈现高低评分细胞混合分布。
3.3. DUB高评分与低评分细胞的转录组差异
通路富集分析显示，与DUB低评分细胞相比，DUB高评分细胞中多数肿瘤相关通路上调，包括移植物排斥、炎症反应、干扰素γ反应、NF-κB介导的TNF-α信号和IL6-JAK-STAT3信号通路。下调通路包括KRAS信号通路、骨骼肌分化、胆汁酸代谢和早期雌激素反应相关信号通路。相关性分析揭示，在DUB低评分细胞中，肥大细胞与NK/T细胞显著相关，内皮细胞与成纤维细胞相关；而在DUB高评分细胞中，NK/T细胞与成纤维细胞强相关。Ro/e分析显示B细胞在DUB低评分组显著富集。
3.4. 两组细胞间通讯差异
细胞通讯分析表明，DUB高评分组的细胞通讯数量显著低于低评分组，但通讯强度更高。DUB低评分组的七种细胞亚型表现出更活跃的通讯行为。信息流比较显示，SPP1、CD99和MK通路在DUB低评分细胞中显著下调。
3.5. DUB相关基因的识别
PCA显示ICGC和TCGA数据集样本无显著批次效应。单变量Cox回归分析识别出78个显著预后基因，其中52个与不良预后相关（如YBX1、RAN、CAP1），26个与良好预后相关（如CYP2C9、PON1、CFHR1）。KEGG富集分析显示这些基因参与FcγR介导的吞噬作用和细菌侵袭等过程。GO分析揭示其在分泌颗粒腔、胶原细胞外基质和内肽酶活性等功能类别中富集。
3.6. 预后模型构建及与免疫微环境的关系
采用101种机器学习算法评估78个基因，基于C-index选择StepCox[both] + RSF模型作为最佳预后工具。生存分析显示，高风险组患者在TCGA和ICGC数据集中均表现出显著较差的预后。ROC曲线分析表明，在TCGA-HCC中，1年、3年和5年AUC分别为0.95、0.94和0.95；在ICGC验证集中，相应AUC为0.74、0.77和0.43。基因表达模式有效区分不同风险评分样本。相关性分析显示，YBX1、PRDX1、SQSTM1、PTTG1、STMN1和FDPS等基因与风险评分呈显著正相关，而PON1呈负相关。免疫微环境分析显示，MHC I、MHC II、其他MHC、共刺激分子和共抑制分子相关基因在DUB低评分样本中表达更高。
4. 讨论
本研究揭示了HCC中DUB基因活性驱动的显著变异。DUB高表达肿瘤细胞显示肿瘤促进通路增强，且DUB高表达主要富集于髓系细胞和肥大细胞，而低表达细胞更多富集B细胞和NK细胞表型。构建的基于DUB表达水平的预后风险特征模型具有重要临床预测价值。研究发现DUB高表达细胞中炎症反应、干扰素γ反应、NF-κB介导的TNF-α信号和IL6-JAK-STAT3信号通路上调，提示更高程度的免疫细胞浸润，表明DUB基因可能参与肝细胞的免疫杀伤和免疫逃逸机制。细胞通讯分析表明DUB高表达细胞具有更强的相互作用强度，SPP1、MK和CD99等高表达提示更活跃的细胞通讯和免疫细胞活性。通过单变量Cox分析鉴定的78个DUB相关基因与细胞周期、转录调控、肿瘤细胞迁移、侵袭、代谢、抗氧化活性和免疫调节密切相关。DAS模型显示出对HCC患者预后的优异预测能力，为基于预测结果的精确患者分层提供了基础，有助于制定个性化治疗策略。尽管存在主要依赖公共数据、缺乏临床样本验证等局限性，但本研究创新性地整合了scRNA-seq和批量RNA测序数据，系统分析了DUB相关基因的表达谱及其在细胞间信号传导和免疫调节中的作用，为后续实验研究和机制探索提供了宝贵参考。
5. 结论
本研究探讨了DUB相关基因在HCC中的作用及其作为预后生物标志物的潜力。发现DUB高表达与免疫相关通路上调和免疫细胞浸润增加相关。开发的基于DUB表达水平的预后模型显示出强大的患者生存预测能力，为HCC风险分层和个性化治疗提供了有价值工具。尽管存在需实验验证等局限性，研究结果突出了DUB在HCC进展中的关键作用及其作为治疗靶点的潜力。需要进一步研究验证这些结果并完善预后模型。
