《Microchemical Journal》：Liquid column and droplets based CRISPR/ AsCas12a-ultra tube microfluidic chip enabling ultra-sensitive and rapid multiplexed pathogen detection
吴尚义|王木珍|徐子禾|刘芳武|董东|黄百成|史新平|阚兴琪|黄兴旭|吴丽娜|郑伟波|田雪梅|王新杰
中国农业科学院深圳农业基因组研究所，农业农村部基因组分析与多组学技术国家重点实验室
摘要
基于CRISPR的检测平台显著提升了快速、精确的核酸（NA）检测能力，适用于即时检测（POC）食品安全和疾病诊断。然而，目前仍迫切需要将易于使用的目标富集技术与多目标分析相结合。本文介绍了一种新型的CRISPR/AsCas12a-ultra集成管式闭环微流控芯片生物传感器（CAT），用于超高灵敏度的多目标检测。首先，我们开发了一种基于闭环液柱和液滴的ERA/CRISPR/AsCas12a-ultra系统，其检测灵敏度是传统CRISPR AsCas12a系统的3倍。其次，我们建立了一个自动化的精密液体操控和实时现场荧光检测平台，能够高效富集并同时检测8个目标。在最佳条件下，CAT可在35分钟内自动纯化并检测病原体NA目标，检测限为0.1拷贝/μL（1拷贝/反应），且荧光强度提高了3倍。该平台可同时检测多种肠道病原体，特异性高达100%。总体而言，CAT是一种通用、快速、灵敏的管式微流控平台，适用于即时检测（POC）中的多重病原体检测。
引言
病原体感染对全球公共卫生构成严重威胁，通常涉及多种病原体的共存[1]。由霍乱弧菌（Vibrio cholerae）和肠道病毒等引起的肠道感染通过粪-口途径或密切接触传播，主要影响5岁以下儿童和免疫功能低下者[2,3]。高通量检测系统对于追踪食品供应链中的病原体传播和耐药性至关重要，尤其是在发展中国家[4,5]。主流的混合感染检测系统（如金标准培养法、PCR和下一代测序）具有高准确性的优点。然而，这些系统需要专业技术人员操作昂贵的仪器，耗时较长，并且并非在全球所有疑似病例中都能使用[6,7]。在多重病原体检测方面，开发一种易于使用、快速、高灵敏度的即时检测（POC）平台将具有重大意义。等温扩增（IA）结合规律间隔短回文重复序列（CRISPR）是一种有前景的快速便捷的核酸检测策略[8,9]。基于CRISPR/Cas的SherLOCK和DETECTR技术为传染性和非传染性疾病的诊断开辟了新途径[10,11]。然而，有限的灵敏度、特异性和假阳性结果限制了其应用。为解决这些问题，开发高性能的Cas蛋白是实现先进CRISPR核酸酶应用的前提。Lachnospiraceae细菌的Cas12a（LbCas12a）和Acidaminococcus属的Cas12a（AsCas12a）是目前最常用的Cas蛋白[12]。超灵敏的工程化AsCas12a蛋白与酶促重组扩增（ERA）结合，在临床应用中已有效用于单拷贝基因的精准检测[13]。但在一锅法检测中，Cas蛋白会形成核糖核蛋白（RNP）复合物，干扰目标NA或扩增子的积累[14]。扩增和检测步骤的分离增加了复杂性及交叉污染的风险，尤其是在多重目标检测时。简化工作流程并减少对复杂仪器的依赖对于更广泛的应用至关重要。如上所述，包括样本输入、DNA提取、IA和CRISPR结果读取在内的检测步骤在一个独立系统中存在挑战[15]。为克服这些限制，人们开发了新的检测技术，以避免封闭设备内不同反应系统之间的干扰。将检测步骤集成到微流控测试平台中，实现了样本到结果的快速检测[16]。微通道、孔洞和液滴的设计用于在微米级腔室内分离IA和CRISPR过程，从而减少NA泄漏[1,17,18]。然而，精确的液体操控和高度复杂的腔室制造进一步增加了简化封闭设备的难度[16,19]。另一方面，比色微流控生物传感器因其简单性、快速性和现场读数能力而成为有前景的POCT工具[20]。核酸检测的比色信号放大策略通常依赖于插入染料、酶介导的级联反应或转录和翻译为酶或其他蛋白质[21,22]。但这些方法受到灵活性限制、需要等温条件以及背景噪声等因素的制约[22,23]。因此，迫切需要探索易于使用、灵敏且封闭式的核酸检测微流控设备。
为了实现高灵敏度的多重病原体通用检测，我们开发了一种集成的、高通量的、易于使用的微流控芯片实时检测生物传感器CAT（基于CRISPR/AsCas12a和管式的微流控芯片生物传感器）。通过优化硅涂层磁珠（SMBs）、使用硅胶管插座连接的闭环芯片以及实时现场荧光强度收集装置，降低了POC检测系统的复杂性，使其更加用户友好。此外，基于工程化AsCas12a-ultra的ERA/CRISPR系统显著增强了FAM标记的单链DNA探针的切割活性。在这个通用的多重目标检测平台中（图1），泵和阀门自动操控NA提取回路中的液柱和8个并行ERA/CRISPR检测回路中的即用型分离试剂液滴。在优化了液滴体积阈值和管材后，样品中的纯化DNA与稳定分散的试剂液滴依次混合，引发ERA和CRISPR反应。CAT的检测限（LoD）为0.1拷贝/μL病原体NA，可同时检测多达8个目标，为快速、灵敏的现场多重病原体检测提供了巨大潜力。
材料与试剂
所有试剂的详细信息见补充材料。
CAT微流控生物传感器的制造
如图S1和S2所示，这款完全集成的微流控生物传感器（长度：30厘米，宽度：20厘米，高度：20厘米）主要由两部分组成：基于管的微流控芯片和操作平台。
基于管的微流控芯片包含四个功能部分（图S1a, b）：(1) 样本收集管（硅胶管，内径：3毫米，外径：5毫米），用于收集MNBs-NA混合物；(2) 洗脱管
CAT生物传感器的液体流动控制原理
为减少DNA气溶胶污染并确保可靠的NA检测结果，自动化、无缝检测设备中的液体操控由泵和阀门控制。泵和阀门负责操控通道附近的液柱。然而，用于ERA和CRISPR反应的微升级试剂容易形成液滴，界面力会阻碍泵的直接驱动[24]。这给微升级试剂的精确输送带来了挑战。
结论
我们开发了一种完全集成的CRISPR/AsCas12a和基于管的微流控病原体NA检测生物传感器（CAT），可在约0.5小时内简单、灵敏、特异性地检测多种肠道病原体及含有HPV的临床宫颈细胞样本。这款基于常见硅胶管和自动化液滴及液柱操控的闭环液体操作平台，确保了ERA和CRISPR在单个管内的顺序反应，大大简化了检测流程。
CRediT作者贡献声明
吴尚义：撰写初稿、验证、方法学设计、数据整理。
王木珍：可视化处理、验证、方法学设计、数据分析、数据整理。
徐子禾：撰写初稿、可视化处理、软件开发、方法学设计、数据分析。
刘芳武：资源提供、方法学设计、概念构思。
董东：软件开发、资源提供、方法学设计。
黄百成：验证工作、资源提供、方法学设计。
史新平：验证工作、资源提供。
阚兴琪：验证工作
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（项目编号：81772533）和国家重点研发计划（项目编号：2021YFC2103300）的支持。
