《Molecular & Cellular Proteomics》：Development of highly multiplex targeted proteomics assays in biofluids using a nominal mass ion trap mass spectrometer
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本研究针对传统免疫分析在蛋白质定量中的局限性，开发了基于Stellar质谱仪的高复用靶向蛋白质组学方法。研究人员通过气相分馏数据非依赖采集技术构建肽段库，结合自适应保留时间对齐算法，在脑脊液和血浆胞外囊泡中实现了对1486种蛋白质的同步定量。结果显示该方法在定量性能上与轨道阱DIA相当，并成功检测到阿尔茨海默病患者脑脊液中Tau蛋白、APOE-ε4等生物标志物的显著变化。这项技术为大规模临床蛋白质组学研究提供了高效解决方案。
在生物医学研究领域，蛋白质定量分析始终是揭示疾病机制的关键环节。虽然免疫分析技术长期以来被视为临床蛋白质检测的金标准，但其固有的局限性日益凸显——抗体交叉反应、定量动态范围有限以及多重检测能力不足等问题，使得科研人员开始寻求更精准的替代方案。质谱技术凭借其高特异性和可多重检测的优势，逐渐成为蛋白质定量领域的新宠。特别是在神经退行性疾病研究中，脑脊液和血浆等生物流体的蛋白质组分析对早期诊断和疗效评估具有重要意义。
然而，传统靶向质谱方法面临严峻挑战：当同时监测的肽段目标超过数百个时，检测灵敏度和定量精度会急剧下降。这个技术瓶颈严重阻碍了蛋白质组学从发现研究向大规模临床应用的转化。正是在这样的背景下，华盛顿大学的研究团队开展了一项创新性研究，他们利用新型混合型名义质量仪器Stellar质谱仪，成功开发出高通量的靶向蛋白质检测方案。
该研究最引人注目的突破在于实现了对上千个蛋白质目标的同步定量。通过巧妙结合气相分馏数据非依赖采集(GPF-DIA)和自适应保留时间对齐(Adaptive RT)技术，研究人员在脑脊液和血浆胞外囊泡样本中分别构建了包含2367和3501个前体离子的检测面板。特别值得关注的是，他们开发的PRM Conductor自动化工具，能够智能优化肽段选择策略，确保在色谱分离的各个时间段均匀分布检测目标。
关键技术方法包括：1）基于气相分馏DIA构建肽段检测库；2）使用PRM Conductor工具优化靶向检测面板；3）采用自适应保留时间对齐算法实时校正色谱漂移；4）建立基质匹配校准曲线评估定量性能。研究纳入了阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病患者的脑脊液(n=37)和血浆样本(n=40)，通过Mag-Net方法富集血浆胞外囊泡进行对比分析。
Scheduling LIT PRM assays with adaptive real-time alignment
研究人员开发了自适应实时对齐算法，该技术通过嵌入参考DIA数据(.rtbin文件)，使质谱仪能够每2.5个液相峰宽周期(约3.5次)自动评估保留时间偏移并更新激活目标列表。这种动态调度机制有效解决了纳流色谱中保留时间重现性差的难题，将每个肽段的监测窗口从传统的2-5分钟压缩至0.75分钟。
A generalized workflow for the development of reproducible, highly multiplex protein PRM assays
研究团队建立了标准化工作流程，通过GPF-DIA技术评估样本基质中可检测的肽段，并利用这些信息指导靶向检测开发。该方法在脑脊液中构建了神经退行性疾病相关蛋白检测面板，在血浆胞外囊泡中开发了调查式检测方案，显著加快了assay开发进程。
Generation and scheduling of PRM assays using gas-phase fractionated libraries
对比轨道阱(OT)和线性离子阱(LIT)GPF库发现，虽然OT库检测到更多肽段(1735个蛋白质)，但基于LIT库构建的检测面板在低浓度样本中表现更优。LIT PRM检测面板包含2248个前体离子(对应876个蛋白质)，在0.1%人脑脊液稀释度下仍保持良好重现性。
Highly multiplex LIT PRM has similar quantitative capacity in CSF as orbitrap DIA
定量性能评估表明，Stellar PRM与Exploris 480 DIA在定量限(LOQ)方面表现相当(中位数分别为9.7%和8.5%)。在基质匹配校准曲线实验中，PRM方法在高浓度样本中的定量精度显著优于DIA，在低浓度区域两者性能相近。
PRM assay size and quantification in Mag-Net enriched plasma EV particles
检测规模比较实验显示，小型检测面板(1599个前体)比大型面板(3501个前体)具有更优的定量性能。在10%人血浆稀释度下，小型面板的变异系数(CV)中位数为24.4%，而大型面板为20.2%，表明适度控制检测规模有利于提高定量准确性。
Stellar MS PRM assay targeting neurodegenerative disease proteins of interest in CSF
针对105个神经退行性疾病相关蛋白构建的专项检测面板，成功识别出29个在阿尔茨海默病患者中显著变化的肽段(对应18个蛋白质)。其中最显著的变化来自Tau蛋白肽段，而APOE-ε4异构体特异性肽段LGADMEDVR的丰度与基因分型结果完全一致，证实了该方法检测单氨基酸变异的可靠性。
Mag-Net enriched plasma EV PRM survey assay
血浆胞外囊泡调查式检测在帕金森病患者中识别出671个显著变化的肽段(对应315个蛋白质组)，包括VCP、CD36等已知帕金森病相关蛋白。基因本体富集分析显示，差异蛋白显著富集于血小板聚集(GO:0070527)和同型细胞粘附(GO:0034109)等通路。
这项研究的创新价值在于建立了可快速实施的靶向蛋白质组学平台，解决了传统方法在检测通量和定量性能之间的平衡难题。通过智能调度算法和优化检测策略，Stellar平台实现了与高端轨道阱仪器相媲美的定量性能，同时大幅降低了设备成本和操作复杂度。特别是在神经退行性疾病生物标志物验证方面，该技术为大规模临床样本的蛋白质组分析提供了实用解决方案。
研究结果证实，基于线性离子阱的高复用靶向蛋白质检测不仅适用于假设驱动式的特定蛋白panel验证，也能胜任非假设驱动的蛋白质组调查分析。这种灵活性使得该方法能够满足不同阶段的研究需求——从生物标志物发现到临床验证研究。随着蛋白质组学在精准医疗中的应用日益深入，这种高效、经济的靶向检测平台有望加速疾病生物标志物的临床转化进程。
