《Plant Direct》：Membranous Interacting Partners of Phage-Type Plastid RNA Polymerase Have Limited Impact on Plastid Gene Expression During Chloroplast Development
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本文系统研究了拟南芥中噬菌体型核编码质体RNA聚合酶（NEP）亚型RPOTmp与其膜互作蛋白（NIP1和NIP2）在叶绿体发育过程中的功能关系。研究通过构建双突变体，结合暗形态建成和去黄化过程分析，发现NIPs对RPOTmp依赖的转录活性影响有限，并基于系统发育分析提出RPOTmp活性在叶绿体分化过程中稳定且不受光和NIPs调控的新模型，为理解质体基因表达调控机制提供了新视角。
引言
在维管植物中，质体基因组编码光合作用及其自身基因表达系统所需的多个基因。在种子植物中，这些基因由两种类型的RNA聚合酶转录，即细菌型质体编码质体RNA聚合酶（PEP）和噬菌体型核编码质体RNA聚合酶（NEP）。真双子叶植物（包括拟南芥）携带两种NEP亚型，RPOTp和RPOTmp。NEPs转录多个质体编码基因，包括PEP的亚基和转运子组分，因此对维持质体功能不可或缺。然而，NEPs的调控机制在很大程度上仍是未知的。RPOTmp在春化过程中从特定启动子转录种子中的16S rRNA基因，其在拟南芥中的突变会延缓叶绿体发育。作为RPOTmp的互作伙伴，两个NEP互作蛋白（NIP1和NIP2）已被鉴定，并被认为在光存在下的叶绿体发育过程中通过将RPOTmp锚定在类囊体膜上来抑制其活性，但它们在转录调控中的确切作用仍有待阐明。
结果
2.1 NIP1和NIP2转录本在吸胀种子中高度积累
先前研究表明NIP蛋白的积累在叶绿体发育过程中被诱导，但尚不清楚哪个NIP基因亚型负责NIP蛋白水平的增加。为了阐明NIP1和NIP2基因在叶绿体发育过程中的表达调控，本研究评估了野生型幼苗在黄化（暗生长）和去黄化（光照射）过程中这些基因的转录水平。与先前证明NIP蛋白在叶绿体发育过程中逐渐积累的研究相反，本研究发现NIP1和NIP2的mRNA水平在暗生长期间的黄化质体发育或光照射后的黄化质体向叶绿体分化过程中并未显著升高，表明NIP蛋白水平可能由翻译或翻译后调控决定。
2.2 nip1 nip2双突变体的分离
为了评估NIP蛋白在质体中的作用，本研究通过杂交NIP1（nip1）和NIP2（nip2）的T-DNA插入突变体，建立了缺失NIP1和NIP2的双突变体（nip1 nip2）。基因分型PCR证实了T-DNA片段在NIP1第二外显子和NIP2的5‘-UTR中的插入。RT-qPCR分析表明，在双突变体中，NIP1和NIP2的表达被抑制到最低水平。与先前研究一致，RPOTmp缺陷突变体（rpotmp）在去黄化过程中表现出下胚轴伸长和叶绿素积累受阻。nip1 nip2双突变体的下胚轴长度和颜色表型与野生型相似，但其叶绿素水平低于野生型，与rpotmp水平相似，表明NIP蛋白不是黄化幼苗下胚轴伸长所必需的，但对光照射后的叶绿体发育有轻微影响。
2.3 NIP蛋白对RPOTmp依赖转录本积累的影响有限
RPOTmp从特定的PC启动子转录rrn16基因。RPOTmp在PC启动子上的转录活性在萌发初始阶段特别强，并在2天内下降。本研究证实，PC启动子起始转录本的丰度在野生型中高于rpotmp突变体，并且在黄化（暗生长）和去黄化（光照射）过程中，野生型中PC启动子区域的转录本水平在吸胀种子中特别高，在暗生长48小时内减少，并且在光照射后几乎保持稳定，表明RPOTmp依赖的rrn16转录不受光处理的影响。为了探究NIP蛋白对RPOTmp功能的影响，本研究比较了野生型和nip1 nip2幼苗中RPOTmp依赖转录本的积累。在吸胀种子中，双突变体中RPOTmp依赖转录本的丰度与野生型相似。尽管双突变体中的转录本水平在暗生长48小时时下降到rpotmp水平，但在96小时及之后的RPOTmp依赖转录本模式在野生型和双突变体中是相似的。此外，已知在rpotmp突变体中水平受抑制的trnAUGC和trnIGAU转录本的积累模式在NIP1和NIP2缺失的情况下也未改变。RPOTmp mRNA的积累模式在NIP1和NIP2突变后也未发生大的改变，尽管在黑暗中的mRNA下降在双突变体中略快。这些结果表明NIP蛋白在去黄化过程中对RPOTmp功能的调节影响较小。
2.4 NIP直系同源物在包括单子叶植物在内的被子植物中保守存在
鉴于RPOTmp是真双子叶植物特有的，本研究假设NIPs也仅存在于真双子叶植物中。为了验证这一假设，构建了NIP相关多肽序列的系统发育树。结果表明，在种子植物中发现的NIP相关肽序列构成两组：一组是被子植物特有的（Group A），包括拟南芥NIP1和NIP2以及菠菜NIP；另一组（Group B）包括来自裸子植物和被子植物的蛋白。Group A又包括包含拟南芥NIP1和NIP2的真双子叶和单子叶植物蛋白（亚组A1）、一个小的真双子叶植物特有的亚组A2以及一个来自基部被子植物（无油樟）的蛋白，表明NIP样蛋白存在于真双子叶和单子叶植物中，该因子的进化起源可追溯到基部被子植物。亚组A1还包括拟南芥核定位的NIP旁系同源物ABA相关RING型E3连接酶（ARRE）。考虑到菠菜NIP和拟南芥NIPs都是质体蛋白，ARRE的核定位可能是该分子群中的一个衍生特征。通过对N末端区域氨基酸组成的分析，支持了亚组A1蛋白（包括无油樟的NIP样蛋白）具有质体蛋白典型特征的观点。
2.5 拟南芥中五种NIP样因子的比较
为了评估拟南芥中NIP同源物的功能冗余性，本研究比对了五种NIP相关蛋白的肽序列。这些蛋白的整体结构可能与NIPs相似，但AT3G20395（Group A2）和AT1G74410（Group B）的N末端区域以及跨膜结构域和RING结构域之间的环区与NIP1和NIP2不同。NIPs与AT3G20395或AT1G74410之间的比对得分低于35%，表明NIPs与这些NIP样因子之间存在功能差异。考虑到NIPs（质体）和ARRE（细胞核）的差异定位，推测在拟南芥的NIP相关因子中，只有NIP1和NIP2在质体中发挥作用。为了进一步检验ARRE在NIP缺失突变体中可能存在的补偿作用，检测了ARRE在黄化和去黄化过程中的转录水平。在野生型中，ARRE的转录模式与NIP2相似。RPOTmp或NIP蛋白的缺失上调了吸胀种子中的ARRE mRNA水平。在48至120小时期间（包括暗到光转换阶段），双突变体中的转录本丰度与野生型相似，但在萌发后144小时，双突变体中的转录本水平略高。这些结果表明，NIPs的缺失在种子春化步骤和叶绿体发育的后期阶段提高了ARRE表达，但在黄化质体向叶绿体分化过程中不影响ARRE表达水平。
讨论
3.1 RPOTmp的功能在黄化质体向叶绿体分化过程中保持稳定
与先前研究一致，本研究的RT-qPCR分析表明，RPOTmp依赖的rrn16转录本以及RPOTmp转录本在吸胀种子中最为丰富，表明RPOTmp在萌发期间质体分化的启动中作用突出。与在包括光合组织在内的组织中普遍表达的RPOTp相反，RPOTmp在非绿色组织（如根和茎尖分生组织）中强烈表达，也支持RPOTmp在未成熟质体中起重要作用的观点。研究发现PC启动子活性在暗萌发幼苗中降低，因此推测RPOTmp在萌发过程中的抑制是独立于光照条件的。研究还揭示，rrn16转录本水平在黄化质体发育和黄化质体向叶绿体分化过程中基本不变，表明RPOTmp的功能在整个萌发后阶段保持稳定，且独立于光照条件。考虑到去黄化过程中叶绿素积累因RPOTmp缺失而延缓，且PC启动子活性在野生型中持续高于rpotmp突变体，RPOTmp在黄化质体和发育中叶绿体中的活性对于光照射后叶绿体的快速分化可能也很重要。
3.2 NIP蛋白对RPOTmp调控的贡献在萌发和绿化过程中有限
基于NIP的表达模式和rrn16的PC启动子活性，先前有假说认为叶绿体发育过程中NIP表达的诱导抑制了RPOTmp的功能。本研究表明，拟南芥中两个NIP基因的突变对植物生长的可见影响极小，尽管轻微抑制了叶绿素水平。NIP缺失幼苗中较低的叶绿素含量与NIP抑制RPOTmp活性的模型不符，因为RPOTmp活性是光下叶绿体快速发育所必需的。由于rpotmp突变体的生长表型是由于RPOTmp在线粒体而非质体中的活性缺失所致，因此NIP从质体中的缺失对生长表型的影响可能非常小。此外，PC启动子活性以及RPOTmp相关的tRNA表达模式在NIP1和NIP2缺失后基本不受影响。基于这些结果，提出了一个修正的RPOTmp调控模型：NIP蛋白在叶绿体发育过程中对RPOTmp调控的影响有限，尽管它们可能调节RPOTmp在质体中的定位，并可能在其他质体分化阶段对RPOTmp活性产生影响。
3.3 NIP蛋白的进化可能独立于RPOTmp
NIP相关多肽的系统发育分析表明，包括单子叶植物、双子叶植物和基部被子植物在内的被子植物携带与已充分鉴定的拟南芥和菠菜NIPs结构相似的蛋白。发现NIP/ARRE群（Group A）是被子植物特有的，在裸子植物中不存在，而另一个NIP相关家族（Group B）存在于裸子植物和被子植物中。基于NIPs与Group B蛋白在进化模式和肽序列上的差异，推测Group B因子可能具有与NIPs不同的功能。拟南芥中亚组A2（AT3G20395）的蛋白与NIPs的比对得分低于Group B因子（AT1G74410）与NIPs的比对得分，因此A2群中的蛋白也不太可能具有NIP样功能。拟南芥中的ARRE与拟南芥和菠菜中的NIPs相似度最高，但其定位于细胞核而非质体。Group A1蛋白N末端相对较高的丝氨酸/脯氨酸百分比和较低的酸性残基百分比支持了这些论点。此外，基部被子植物无油樟中一个Group A蛋白的N末端序列富含丝氨酸和脯氨酸，提示基部被子植物中NIP样蛋白可能存在质体定位。因此，认为质体靶向的NIP样蛋白是在被子植物共同祖先中获得的，而拟南芥（可能还有其他一些被子植物）在后续进化步骤中获得了额外的质体外NIP样蛋白。
结论
本研究分离了拟南芥缺失两种NIP亚型的双突变体，这两种亚型与RPOTmp互作，并被假设在叶绿体分化过程中调节其活性。nip1 nip2双突变体未表现出明显的生长表型，并且几乎不影响萌发、黄化和去黄化过程中的RPOTmp依赖转录模式。此外，研究证明NIP相关蛋白的系统发育模式与RPOTmp不同。基于这些发现，得出结论：NIP蛋白在叶绿体分化过程中的功能极不可能与RPOTmp活性的调控相关。
