《SCIENCE ADVANCES》：Nat10-mediated ac4C epitranscriptomics orchestrates hematopoietic stem/progenitor cell fate determination via translation control
编辑推荐：
本研究针对造血干细胞（HSC）命运决定过程中转录因子（TF）蛋白丰度调控机制不清的问题，开发了ULAC-seq技术，绘制了造血干细胞/祖细胞（HSPC）中ac4C动态修饰图谱。研究发现Nat10介导的ac4C通过增强关键造血转录因子（如Nfix）的mRNA翻译，而非稳定性，来调控HSC稳态和分化，缺失Nat10会导致胚胎及出生后造血衰竭。该研究揭示了ac4C依赖的翻译控制是HSC维持和功能的关键表观转录组-转录组调控轴，为理解正常造血调控提供了新视角。
在生命的长河中，造血系统如同一个永不枯竭的源泉，持续为机体提供各类血细胞。这个复杂过程的核心是造血干细胞（HSC），它们拥有自我更新和多向分化的双重能力，精准地平衡着自我复制与分化，以维持终身的造血稳态。然而，这个精密平衡是如何被调控的，尤其是决定细胞命运的“开关”分子——转录因子（TF）——其蛋白水平的精确控制机制，仍是领域内亟待解决的关键科学问题。
近年来，RNA修饰，即“表观转录组学”，作为基因表达调控的新前沿，逐渐崭露头角。其中，N6-甲基腺苷（m6A）的研究较为深入，其在造血中的作用已被广泛报道。然而，另一种重要的RNA修饰——N4-乙酰胞苷（ac4C），其催化酶为N-乙酰转移酶10（NAT10），在正常造血过程中的功能却鲜为人知。此前的研究多聚焦于ac4C在恶性肿瘤（如白血病）中的作用，但它在生理状态下，尤其是在稀缺且功能关键的造血干细胞/祖细胞（HSPC）群体中，究竟扮演什么角色，仍然是一个未解的谜团。探索ac4C在正常造血中的作用，不仅有助于完善基因表达调控的网络，也可能为理解造血发育异常及相关疾病提供新的线索。
为了回答这些问题，一项发表在《SCIENCE ADVANCES》上的研究应运而生。研究人员开发了一种名为超低输入乙酰化RNA免疫共沉淀测序（ULAC-seq）的新技术，成功绘制了小鼠不同HSPC亚群中ac4C的动态修饰图谱，并深入探究了其催化酶Nat10在造血干细胞维持和分化中的关键作用及分子机制。
为开展本研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术：首先，他们开发了ULAC-seq技术，用于在纳克级RNA输入量下高灵敏度地绘制稀有HSPC亚群中的ac4C修饰图谱；其次，利用条件性基因敲除小鼠模型（Mx1-cre; Nat10fl/fl和 Vav-cre; Nat10fl/fl）在体和离体研究Nat10的功能；第三，通过流式细胞术分选、体外集落形成实验、竞争性重建实验等评估HSC功能；第四，结合蛋白质组学（Orbitrap Astral质谱）和转录组学（RNA-seq, scRNA-seq）多组学分析，寻找Nat10的关键靶点；最后，通过救援实验验证关键靶点基因（如Nfix）的功能。
动态ac4C景观跨越HSPC层级
研究人员首先通过RNA测序（RNA-seq）发现，与成熟血细胞相比，HSPC中RNA/mRNA修饰相关通路显著富集，其中ac4C的写入酶Nat10表达上调，提示其潜在作用。为了解析ac4C在稀有HSPC中的分布，他们开发了ULAC-seq技术。应用该技术对分选的6种小鼠BM HSPC亚群进行ac4C测序，揭示了ac4C修饰具有高度动态性和细胞类型特异性。值得注意的是，红系-巨核系祖细胞（MEP）中的ac4C水平和峰值数量最高，这与Nat10在MEP中表达最高相一致。功能分析显示，细胞类型特异的ac4C峰相关基因富集于与该细胞类型功能相关的通路中。这些结果表明，Nat10介导的ac4C修饰可能参与造血过程中细胞身份的建立。
Nat10纯合缺失损害HSC并破坏正常造血
为了探究ac4C是否在体内调控造血，研究人员构建了诱导型条件性敲除小鼠模型（Mx1-cre; Nat10fl/fl，简称Nat10-cKO）。成年小鼠注射pIpC诱导Nat10缺失后，外周血白细胞、血小板、红细胞计数以及BM细胞总数均显著降低，表明Nat10对正常造血至关重要。进一步流式分析发现，Nat10缺失导致长期HSC（LT-HSC）和短期HSC（ST-HSC）的频率和绝对数量显著减少，而多能祖细胞2（MPP2）增加，同时淋系祖细胞（CLP）、髓系祖细胞（CMP）及其下游成熟细胞减少，但MEP却异常积累。单细胞RNA测序（scRNA-seq）结果与流式分析一致，确认了Nat10-cKO小鼠中LT-HSC和ST-HSC减少而MEP增加。这些发现表明Nat10缺失破坏了HSC池稳态，并可能阻断了MEP的分化。
Nat10是胎儿造血所必需的
为了研究Nat10在胚胎造血中的作用，研究人员构建了Vav-cre; Nat10fl/fl（vcNat10-/-）小鼠模型。他们发现vcNat10-/-会导致胚胎致死。在胚胎期第13.5-14.5天（E13.5-E14.5），vcNat10-/-胚胎的肝脏变小、呈现贫血迹象，肝脏细胞总数和LK细胞频率及数量均显著减少，其胎肝细胞的体外集落形成能力也严重受损。这表明Nat10在胚胎期HSC维持中同样发挥关键作用。
Nat10缺失引起细胞固有的HSC重建和分化缺陷
机制探索发现，Nat10缺失的HSC更多地退出G0期（静止期）进入细胞周期，且凋亡增加，提示HSC池过早耗竭。体外集落形成实验表明，Nat10缺失的HSPC形成集落的数量、大小以及CD11b+细胞比例均显著降低。重要的是，回补野生型NAT10能挽救Nat10缺失导致的集落形成和分化缺陷，而其催化死亡突变体（G641E）或解旋酶结构域缺失突变体（Δhelicase）则不能，说明Nat10的ac4C写入酶活性是其功能所必需的。竞争性重建实验进一步证实，无论是先敲除后移植还是先移植后诱导敲除，Nat10缺失都会导致供体来源细胞在初级和次级移植受体中的嵌合水平显著降低，证明Nat10是HSC维持和长期重建能力的细胞内在调控因子。
Nat10是MEP分化所必需的
对MEP下游谱系的细致分析发现，尽管MEP积累，但巨核系祖细胞（MkP）、巨核细胞（Mk）以及红系分化各个阶段的细胞（proE, EryA, EryB, EryC）在Nat10-cKO小鼠BM中均显著减少。分选的Nat10缺失MEP在体外难以形成集落。scRNA-seq显示，Nat10缺失的MEP中下调的基因富集于红细胞分化和发育相关通路。这些结果综合表明，Nat10缺失导致HSC稳态紊乱，其特征是HSC池减少、分化偏向MPP2-MEP路径，但MEP向终末分化受阻，从而异常积累并导致下游红系和巨核系细胞缺失。
鉴定HSPC中Nat10的靶基因
通过ULAC-seq比较WT和Nat10-cKO小鼠Lin-HSPC的ac4C谱，发现Nat10缺失导致ac4C全局性降低，并鉴定出3118个可靠的低乙酰化峰，其中大部分（81.72%）具有细胞类型特异性。许多关键造血TF（如Nfix, Lcor, Erg, Smad2）的ac4C水平在Nat10缺失后显著下调。整合ac4C谱和基因表达数据发现，ac4C水平变化与基因mRNA表达变化无相关性，提示ac4C可能影响mRNA翻译而非稳定性。随后，研究人员对少量（3000个）WT和Nat10缺失HSC进行了高灵敏度蛋白质组学分析。结果显示，ac4C修饰的mRNA所编码的蛋白质在Nat10缺失后其水平降低更显著。他们聚焦于136个既是ac4C修饰目标又在Nat10缺失后蛋白水平下降的基因，这些基因功能富集于细胞静止、巨核细胞发育、翻译、干细胞群体维持等通路。在HSC相关TF中，Nfix、Kit和Tal1在Nat10缺失后蛋白水平下降而mRNA水平不变，被确定为候选靶点。
Nfix是Nat10维持HSC功能的关键靶点
Nfix因其在HSC维持和MEP分化中的已知作用而被选为重点研究对象。IGV可视化及ULAC-qPCR证实Nfix mRNA在HSC中ac4C修饰水平最高，且该修饰在Nat10缺失后显著降低。蛋白质印迹验证了Nfix和Kit蛋白水平在Nat10缺失的Lin-HSPC中下降。功能上，回补Nfix能显著挽救Nat10缺失HSPC的集落形成缺陷和在体重建能力缺陷，效果优于回补Kit，表明Nfix是Nat10的关键下游效应分子。进一步分析发现，Nfix的靶基因（如Mpl, Irf8, Itga2b）在Nat10缺失的HSPC中表达下调。RNA免疫共沉淀（RIP）实验表明，Nat10敲低会抑制Eif3复合物与Nfix mRNA的结合，提示Nat10介导的ac4C通过招募Eif3来增强靶mRNA的翻译。
本研究确立了Nat10通过催化ac4C修饰关键转录因子（如Nfix）的mRNA，进而增强其翻译效率（而非影响mRNA稳定性），从而在转录后水平精确调控蛋白质丰度，最终协调HSC命运决定的新机制。这一“表观转录组-转录组”调控轴的发现，深化了对正常造血稳态维持的理解，将RNA修饰与转录调控网络紧密联系起来。研究所开发的ULAC-seq技术为在稀有细胞群体中研究ac4C及其他RNA修饰提供了有力工具。值得注意的是，生理水平的Nat10对造血至关重要，而其部分抑制可能被耐受，这为靶向NAT10治疗其依赖的恶性肿瘤（如白血病）而不严重损害正常造血提供了潜在的治疗窗口。总之，该研究揭示了ac4C在正常造血中的核心作用，为探索造血发育异常及相关疾病的病理机制和潜在治疗策略提供了新的理论基础和视角。
