人类CD4+T细胞中干细胞记忆亚群预先决定细胞毒性程序的特异性研究

《SCIENCE ADVANCES》：A distinct subset of stem-cell memory is poised for the cytotoxicity program in CD4+ T cells in humans

本研究针对CD4+细胞毒性T淋巴细胞（CD4-CTLs）的谱系发育和功能潜力认识不足的问题，通过整合多组学分析，揭示了人类CD4+T细胞记忆库中存在一个独特的干细胞记忆（TSCM）亚群（TSCM-CTL），该亚群预先决定并驱动CD4-CTLs的分化。研究证实CD4-CTLs与CD8-CTLs具有相似的细胞毒性程序，并建立了从初始T细胞（TN）到TSCM-CTL再到效应细胞的体外分化模型，阐明了其表观遗传调控机制。该发现为疫苗开发和细胞疗法提供了新的靶点和策略，对精准医学具有重要意义。

　　

在免疫系统的精密防御网络中，T细胞扮演着核心角色。传统上，CD8⁺T细胞被认为是主要的“杀手”细胞，负责清除受感染的细胞或癌细胞。然而，另一类不那么为人所知的“杀手”——CD4⁺细胞毒性T淋巴细胞（CD4-CTLs），虽然早在几十年前就被发现存在于多种感染性疾病、癌症和自身免疫病中，但其起源、发育路径和功能潜力始终笼罩在迷雾之中。与CD8-CTLs相比，CD4-CTLs的研究相对滞后，这限制了其在疫苗设计、免疫治疗等领域的应用潜力。一个核心的科学问题是：CD4⁺T细胞，通常以“辅助”功能著称，是如何获得强大的细胞毒性能力的？它们的“记忆”是如何形成和维持的？是否存在一个长期的“干细胞样”记忆库，能够快速响应威胁，分化为效应细胞？解答这些问题，对于理解适应性免疫的全面性以及开发新的治疗策略至关重要。发表在《SCIENCE ADVANCES》上的这项研究，正是为了拨开这重重迷雾。

研究人员综合运用了流式细胞术、体外T细胞极化培养模型、RNA测序（RNA-seq）、T细胞受体测序（TCR-seq）、 assay for transposase-accessible chromatin using sequencing（ATAC-seq，用于分析染色质开放性）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞ATAC测序（scATAC-seq）等多种技术手段。研究样本来源于健康捐赠者的外周血单核细胞（PBMCs）。

研究结果

CD4-CTLs和CD8-CTLs的细胞毒性程序难以区分

通过对来自相同供体的CD4-CTLs（主要富集于CD4-T_EMRA效应记忆亚群）和CD8-CTLs（CD8-T_EMRA）进行平行分析，转录组学和蛋白质表达水平（如GZMB, PRF1, GNLY, CX3CR1, GPR56等）的比较表明，两者在细胞毒性相关基因的表达上高度相似，主成分分析（PCA）中聚集在一起，基因集富集分析（GSEA）也未显示显著差异。TCR repertoire分析进一步揭示，两者均呈现高度的克隆扩增，表明它们都是抗原驱动的效应细胞。这些结果表明，CD4-CTLs拥有与经典CD8-CTLs相媲美的细胞毒性潜力。

CD4⁺T_SCM展现双重特征

为了追溯CD4-CTLs的发育谱系，研究人员深入分析了CD4⁺T细胞的各个记忆亚群（T_N, T_SCM, T_CM, T_EM, T_EMRA-P, T_EMRA-E）的转录组和染色质开放性（ATAC-seq）。研究发现，干细胞记忆T细胞（T_SCM）同时高表达与长期存活/干细胞特性相关的基因（如TCF7, CD27）和细胞毒性效应基因（如GZMB, PRF1），表现出独特的“双重特征”。TCR克隆型共享分析显示，效应性CD4-T_EMRA-E中扩增的克隆型在T_SCM亚群中有显著共享，提示T_SCM可能是CD4-CTLs的前体细胞。

在T_SCM内鉴定出T_SCM-CTL亚群

通过scRNA-seq和scATAC-seq对T_SCM细胞进行高分辨率解析，发现其内部存在高度异质性。其中，两个特定的细胞簇（簇11和12）特异性地高表达细胞毒性分子（GZMB, GNLY, PRF1）和关键转录因子（如TBX21, ZEB2, ZNF683），被定义为T_SCM-CTL细胞。scATAC-seq分析显示，这些细胞的染色质在细胞毒性基因的调控区域和基因体区域呈现更高的开放性，并且富集了T-bet、EOMES等细胞毒性相关转录因子的结合 motif，表明其表观遗传状态已为细胞毒性程序的启动做好了准备。此外，这些T_SCM-CTL细胞共表达TOX和PD1，类似于CD8⁺T细胞中描述的干细胞样前体细胞。

CD4-CTLs源自T_SCM-CTL细胞

整合scRNA-seq和配对scTCR-seq数据分析T_SCM和T_EMRA细胞，发现T_SCM-CTL细胞（对应于整合数据中的簇13和14）与CD4-T_EMRA效应细胞共享大量TCR克隆型。这些共享的克隆型在T_SCM中频率很低，但在T_EMRA中高度扩增，提供了强有力的证据，表明T_SCM-CTL是CD4-CTL效应细胞在体内的直接前体。

CD4 T_N细胞向CD4-CTL表型的体外分化

研究人员建立了一个体外分化模型，通过在T_H1极化条件（IL-12, IFN-γ, 抗IL-4/IL-17抗体）下反复刺激纯真的CD4⁺T_N细胞，成功诱导其表达细胞毒性分子（GZMB, PRF1, GNLY），并具备杀伤靶细胞的能力。scRNA-seq追踪分化过程显示，细胞经历了从纯真状态到效应状态的转变，并鉴定出具有不同细胞毒性水平的中间群体。scATAC-seq分析进一步揭示了伴随分化过程，细胞毒性基因位点的染色质开放性逐渐增加，重现了体内T_SCM-CTL到T_EMRA-E的表观遗传变化轨迹。

T_SCM细胞在T_H1极化条件下比纯真（T_N）细胞更快获得细胞毒性

对比实验表明，以T_SCM细胞为起始群体进行T_H1极化，比从T_N细胞开始，能更快速地获得高表达细胞毒性分子的效应细胞，并且克隆扩增更为显著。这进一步支持了T_SCM，特别是其中的T_SCM-CTL亚群，是更接近效应阶段的CD4-CTL前体。

研究结论与意义

本研究系统性地阐明了人类CD4-CTLs的发育谱系，首次鉴定出存在于CD4⁺T_SCM记忆库中的、预先决定向细胞毒性命运分化的T_SCM-CTL亚群。研究证实CD4-CTLs在分子水平上与CD8-CTLs同样强大，破除了对其细胞毒性潜能的质疑。通过体外分化模型，研究不仅验证了从T_N经T_SCM-CTL到效应细胞的线性发育路径，还揭示了其背后动态的表观遗传重编程过程。

这项研究的发现具有多重重要意义：首先，它深化了对CD4⁺T细胞功能多样性和记忆形成的理解。其次，它表明在疫苗设计和评估中，应同时关注CD4-CTLs和CD8-CTLs的反应，这可能为针对某些免疫逃逸策略的病原体提供更有效的保护。再者，鉴定出的T_SCM-CTL亚群及其关键调控因子，为开发基于CD4-CTLs的过继性细胞疗法（如用于癌症治疗）提供了新的细胞来源和靶点。最后，建立的体外高效生成具有长期存活潜力的CD4-CTLs的方法，为将其转化为临床应用铺平了道路。总之，该研究为探索CD4-CTLs在感染性疾病、癌症和自身免疫病等多种疾病中的治疗潜力奠定了坚实的理论基础和技术支撑。