《Breast Cancer: Targets and Therapy》：The Novel ROCK Inhibitor Fasudil Derivative Fasudil-D-6h Prevents Tumour Progression by Regulating the Adherens Junction Signalling Pathway in Triple-Negative Breast Cancer
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本文推荐了一种新型ROCK抑制剂Fasudil-D-6h，其通过独特地调控黏附连接（AJ）信号通路，显著抑制三阴性乳腺癌（TNBC）细胞增殖、诱导凋亡并恢复上皮完整性。研究结合转录组学与体内外实验，证实该衍生物能有效下调ROCK1/2，上调CDC42、ZO-1等关键蛋白，展现优于母体化合物Fasudil的疗效与临床转化潜力。
Fasudil-D-6h抑制TNBC细胞增殖并促进其凋亡
为了阐明新型ROCK抑制剂Fasudil-D-6h对三阴性乳腺癌（TNBC）细胞的影响，研究首先在MDA-MB-231细胞中检测了该化合物对ROCK1和ROCK2 mRNA表达水平的作用。qRT-PCR结果显示，与未处理（0 μM）的阴性对照组相比，使用5 μM或10 μM浓度的Fasudil-D-6h或阳性对照药HA-1100（10 μM）处理24小时后，MDA-MB-231细胞中ROCK1和ROCK2的mRNA水平均显著降低。这表明Fasudil-D-6h能够有效抑制TNBC细胞中ROCK1/2的表达。
进一步的功能实验揭示了Fasudil-D-6h的强大抗肿瘤活性。CCK-8细胞增殖实验表明，在处理96小时后，5 μM和10 μM的Fasudil-D-6h或10 μM的HA-1100均能显著抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖。值得注意的是，在相同浓度（10 μM）下，Fasudil-D-6h对细胞增殖的抑制效果强于HA-1100。流式细胞术检测细胞凋亡的结果进一步验证了其促凋亡作用。在MCF-7和MDA-MB-231细胞中，10 μM Fasudil-D-6h处理组相较于5 μM处理组，早期和晚期凋亡细胞比例均显著增加。综上所述，Fasudil-D-6h能够下调ROCK1/ROCK2的表达，抑制TNBC细胞增殖并促进其凋亡。
黏附连接和乳腺癌信号通路参与Fasudil-D-6h对MDA-MB-231细胞的作用机制
为了深入探索Fasudil-D-6h的作用机制，研究对经10 μM Fasudil-D-6h处理的MDA-MB-231细胞进行了转录组测序。通过差异表达分析，共鉴定出8092个差异表达基因（DEGs），其中4123个基因上调，3969个基因下调。
对这些DEGs进行基因本体（GO）富集分析发现，它们在细胞组分（CC）域中显著富集于“细胞-基质黏附连接”；在生物过程（BP）域中显著富集于“Wnt信号通路正调控”、“DNA损伤反应的内在凋亡信号通路”；在分子功能（MF）域中显著富集于“含基团的转移酶活性”、“嘌呤核糖核苷酸结合”。更重要的是，京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析显示，所有DEGs在“黏附连接”和“乳腺癌信号通路”中显著富集。这一无偏倚的转录组学分析提示，黏附连接通路是Fasudil-D-6h作用的关键靶点。
Fasudil-D-6h上调MDA-MB-231细胞中黏附连接信号通路相关基因的表达
基于转录组学结果，研究构建了ROCK1、ROCK2及差异表达的黏附连接通路相关基因编码蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。该网络提示了这些基因之间可能存在新的相互作用关系，为理解Fasudil-D-6h的复杂作用机制提供了线索。
研究进一步通过qRT-PCR和Western blotting在分子和蛋白水平上验证了Fasudil-D-6h对黏附连接通路关键组分的影响。qRT-PCR结果显示，与未处理组相比，经5 μM或10 μM Fasudil-D-6h或HA-1100处理的MDA-MB-231细胞中，Cdc42、Rac3、Src、ZO-1、Occludin和Claudin-1的mRNA表达水平均显著升高。Western blotting结果与之高度一致，CDC42、RAC3、SRC、ZO-1、Occludin和Claudin-1的蛋白表达水平在Fasudil-D-6h处理组也呈现剂量依赖性的显著上调。这些结果强有力地证实，Fasudil-D-6h能够通过抑制ROCK活性，显著上调TNBC细胞中与黏附连接和紧密连接完整性密切相关的关键基因的表达。
Fasudil-D-6h抑制裸鼠皮下乳腺癌肿瘤的生长
为了评估Fasudil-D-6h的体内抗肿瘤效果，研究建立了MDA-MB-231细胞的裸鼠皮下移植瘤模型。当肿瘤长至一定大小后，将荷瘤鼠随机分为三组：对照组（注射生理盐水NS）、低剂量组（10 mg/kg Fasudil-D-6h）和高剂量组（20 mg/kg Fasudil-D-6h），每周进行瘤周注射。
观察发现，与NS对照组相比，10 mg/kg和20 mg/kg Fasudil-D-6h处理组的肿瘤生长均受到显著抑制。实验结束时剥离肿瘤并进行称重和体积测量，结果显示两个Fasudil-D-6h治疗组的肿瘤质量和平均体积均显著小于对照组。这表明Fasudil-D-6h在体内也能有效抑制TNBC肿瘤的生长。
Fasudil-D-6h上调裸鼠皮下乳腺癌肿瘤中黏附连接信号通路相关基因的表达
最后，研究在动物模型水平验证了Fasudil-D-6h对靶通路的作用。qRT-PCR检测显示，与正常组织相比，NS对照组肿瘤组织中ROCK1和ROCK2的mRNA水平显著升高，而Cdc42、Rac3、Src、ZO-1、Occludin和Claudin-1的mRNA水平显著降低。然而，在10 mg/kg和20 mg/kg Fasudil-D-6h治疗组的肿瘤组织中，ROCK1/ROCK2的表达被显著下调，而上述黏附连接相关基因的表达则被显著上调。Western blotting分析进一步在蛋白水平证实了这一趋势：Fasudil-D-6h治疗能够显著逆转肿瘤组织中CDC42、RAC3、SRC、ZO-1、Occludin和Claudin-1蛋白的低表达状态。这些体内实验数据一致表明，Fasudil-D-6h通过调控ROCK及黏附连接通路关键分子，发挥其抑制肿瘤生长的作用。
总结与展望
本研究系统论证了新型ROCK抑制剂Fasudil-D-6h对三阴性乳腺癌的显著抗肿瘤活性。其作用机制独特，不仅限于抑制细胞增殖和促进凋亡，更重要的在于通过下调ROCK1/2，积极上调CDC42、RAC3、ZO-1、Occludin、Claudin-1等一系列关键蛋白的表达，从而恢复被破坏的黏附连接和紧密连接，重塑上皮完整性。这种以“稳定细胞连接”为核心的作用机制，为对抗TNBC的高侵袭性和转移性提供了新的治疗思路。相较于其母体化合物Fasudil（已临床用于治疗脑血管痉挛）和研究常用工具药Y-27632，Fasudil-D-6h显示出更强的效力和独特的机制侧重，因其源于已临床验证的药物而具备良好的转化潜力。未来研究将集中于深入阐明其调控黏附连接通路的精细分子机制，探索其与标准化疗的联合疗效，并推进其临床前和临床转化评估，有望为TNBC患者带来新的希望。
