《Cancer Management and Research》：Methylation and Expression Analysis of POU4F2, HOXA9, RBM46, and TSGA10 Genes in Bladder Cancer Using Methyl-Sensitive Restriction Enzyme PCR (MSRE-PCR)
编辑推荐：
本研究通过甲基化敏感限制性内切酶PCR（MSRE-PCR）技术，系统评估了膀胱癌患者尿液和血浆中POU4F2、HOXA9、RBM46和TSGA10四个基因的甲基化状态及其表达变化。结果显示，膀胱癌患者尿液cfDNA中这四个基因的启动子甲基化水平显著高于健康对照（约2.2至9.0倍，p < 0.0001），其诊断效能优异（AUC = 0.88–0.98）。主成分分析（PCA）衍生的复合甲基化评分进一步提升了鉴别能力（AUC = 0.993）。基因表达分析发现POU4F2和HOXA9表达下调，而RBM46和TSGA10表达上调。这些发现表明，联合检测上述基因的甲基化与表达谱，可作为一种高灵敏度、高特异性的非侵入性生物标志物组合，为膀胱癌的早期诊断提供了新途径。
研究背景
膀胱癌是全球常见的泌尿系统恶性肿瘤，2020年新发病例约57.3万例，死亡约21.3万例。约70-75%的新发病例为非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC），其复发率高达70%，进展为肌层浸润性膀胱癌（MIBC）的风险为10-20%。目前膀胱癌诊断的金标准是膀胱镜检查，但其具有侵入性；尿液细胞学检查特异性高但灵敏度低，尤其对低级别肿瘤。因此，开发非侵入性、高灵敏度的诊断方法至关重要。DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰，在肿瘤发生发展中起关键作用，利用尿液中的细胞游离DNA（cfDNA）进行甲基化分析为膀胱癌的无创诊断提供了新思路。
患者与方法
本研究为病例对照研究，共纳入22例经病理证实为尿路上皮癌（移行细胞癌）的膀胱癌患者（其中低级别15例，高级别7例）和30名年龄匹配的健康对照。收集所有受试者的晨尿和血浆样本。使用商业试剂盒提取cfDNA和总RNA。采用甲基化敏感限制性内切酶PCR（MSRE-PCR）技术评估POU4F2、HOXA9、RBM46和TSGA10基因的甲基化状态，其中POU4F2、RBM46和TSGA10基因使用HhaI酶，HOXA9基因使用HpaII酶。基因表达水平通过实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）进行检测。使用GraphPad Prism 9软件进行统计学分析，组间比较采用非配对t检验和ANOVA检验，p < 0.05认为有统计学意义。通过受试者工作特征（ROC）曲线评估诊断效能，并利用主成分分析（PCA）构建复合甲基化评分。
结果
甲基化分析结果
在尿液样本中，膀胱癌患者POU4F2、HOXA9、RBM46和TSGA10基因的启动子甲基化水平均显著高于健康对照组（分别约为对照组的2.2、9.0、3.6和6.1倍；所有p < 0.0001）。在血浆样本中也观察到类似的趋势，但差异幅度小于尿液样本（p = 0.0005–0.0278）。ROC曲线分析显示，尿液甲基化对膀胱癌的诊断效能优异：POU4F2的曲线下面积（AUC）为0.97，HOXA9为0.95，RBM46为0.88，TSGA10为0.98（灵敏度95-100%，特异性80-100%；所有p < 0.0001）。PCA衍生的复合甲基化评分进一步提高了诊断准确性，AUC达到0.993（95% CI 0.974–1.000），灵敏度为100%，特异性为95%（p < 0.001）。
基因表达分析结果
基因表达分析显示，与对照组相比，膀胱癌患者尿液中POU4F2和HOXA9基因的表达显著下调（分别下降约7倍和9倍；p = 0.0099和p = 0.025），而RBM46和TSGA10基因的表达显著上调（分别增加约2.5倍和2.3倍；p = 0.0037和p = 0.0114）。这表明启动子高甲基化与POU4F2和HOXA9的表达沉默相关，而RBM46和TSGA10的高甲基化并未导致其表达下调，提示可能存在更复杂的基因调控机制。
细胞系验证
在膀胱癌细胞系5637和EJ138中，所有四个基因均表现出高甲基化状态，与文献报道的膀胱癌细胞系普遍存在启动子高甲基化一致，进一步支持了其在膀胱癌中的表观遗传学改变。
讨论
本研究结果表明，POU4F2、HOXA9、RBM46和TSGA10基因在膀胱癌中存在显著的甲基化改变和表达失调，尤其是在尿液cfDNA中检测这些变化具有很高的诊断价值。尿液作为检测样本优于血浆，可能因其更接近肿瘤部位，含有更高浓度的肿瘤源性cfDNA。POU4F2和HOXA9的高甲基化导致其表达下调，符合经典的"高甲基化-基因沉默"模型。而RBM46和TSGA10在高甲基化的情况下表达反而上调，其机制可能涉及甲基化对非启动子区域的影响、替代启动子的使用或上游抑制因子的沉默等。单个基因及PCA复合评分均显示出优异的诊断性能（AUC 0.88-0.993），灵敏度（95.45-100%）和特异性（80-100%）高，优于传统的尿液细胞学检查。这为非侵入性膀胱癌诊断生物标志物面板的开发提供了有力证据。
结论
本研究证实，检测尿液cfDNA中POU4F2、HOXA9、RBM46和TSGA10基因的甲基化状态和表达水平，能有效区分膀胱癌患者与健康人群，具有极高的诊断潜力。这种基于尿液的多基因甲基化与表达联合分析策略，为膀胱癌的早期、无创诊断和监测提供了新的、有前景的方法。未来的研究需要在更大样本量和更广泛临床场景中进行验证，并探索其在预后判断和复发监测中的应用价值。
