《Research》：Novel LncRNA Gm44763 Regulates Morphine-Induced Reward Memory via MiR-298-5p-Mediated eIF4E Translation Control
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本研究针对药物成瘾中奖赏记忆形成的分子机制尚不明确的问题，通过转录组学分析和功能验证，首次发现内侧前额叶皮质（mPFC）神经元中lncRNA Gm44763可通过海绵吸附miR-298-5p解除其对eIF4E的抑制，进而调控突触可塑性与吗啡诱导的奖赏记忆。该研究揭示了Gm44763/miR-298-5p/eIF4E轴作为连接转录与翻译调控的新通路，为物质使用障碍提供了潜在治疗靶点。
药物成瘾是困扰全球的公共卫生问题，其核心特征之一是对药物的强烈渴求和难以遏制的复吸行为。研究表明，药物关联的奖赏记忆在成瘾的形成和复发中起着关键作用。然而，这种病理性记忆形成的分子机制尚不完全清楚，尤其是长链非编码RNA（lncRNA）在其中扮演的角色仍有待探索。内侧前额叶皮质（mPFC）作为整合环境信息与动机驱动的高级脑区，在药物寻求行为和奖赏记忆维持中至关重要。以往研究多聚焦于多巴胺、谷氨酸等经典神经递质系统，近年来表观遗传和转录后调控的重要性日益凸显，其中lncRNA作为重要的调控分子，在突触可塑性和记忆中的作用逐渐被认识，但在药物成瘾背景下的具体功能知之甚少。
为了深入探究吗啡诱导奖赏记忆的分子基础，研究人员开展了此项研究。他们通过建立吗啡诱导的条件性位置偏爱（CPP）小鼠模型，模拟了与成瘾相关的奖赏记忆行为。利用转录组测序（RNA-seq）技术，他们首次系统描绘了吗啡CPP模型小鼠mPFC脑区的lncRNA表达谱，从中鉴定出126个差异表达的lncRNA（DElncRNA）。通过生物信息学分析和实验验证，研究人员将目光锁定在一个表达显著下调且功能未知的lncRNA——Gm44763上。
为了阐明Gm44763的功能，研究团队运用了多种关键技术方法。这些方法包括：行为学测试（如条件性位置偏爱CPP、旷场测试OFT、高架十字迷宫EPM等）以评估奖赏记忆和相关行为；病毒介导的基因操作（如慢病毒LV过表达Gm44763、腺相关病毒AAV过表达miR-298-5p、antagomir抑制miR-298-5p）实现在体特定脑区的基因功能增益或缺失；分子生物学技术（如定量实时聚合酶链反应qPCR、蛋白质印迹Western blot、RNA免疫共沉淀RIP、双荧光素酶报告基因检测）用于验证分子间的相互作用和表达水平；形态学分析（高尔基染色Golgi staining）用于观察神经元树突复杂度和树突棘密度；以及在体光纤光度记录（Fiber photometry）用于实时监测mPFC神经元的钙活动动态，反映神经元兴奋性。此外，还采用了表面传感翻译（SUnSET） assay评估整体蛋白质合成水平，以及免疫共沉淀（IP）分析蛋白质相互作用。
筛选并鉴定Gm44763作为调控吗啡诱导奖赏记忆的候选lncRNA
研究人员从RNA-seq筛选出的DElncRNA中，随机选取了表达上调和下调的候选分子进行qPCR验证，发现Gm44763的表达变化最为显著，且在吗啡CPP小鼠mPFC中表达显著下调。RNA荧光原位杂交（FISH）进一步证实了这一结果。亚细胞定位分析显示Gm44763主要富集于神经元胞质中。区域特异性分析表明，Gm44763的下调仅发生在mPFC，而在伏隔核（NAc）、基底外侧杏仁核（BLA）或海马（Hipp）中未见明显变化。生物信息学分析（如CPAT、CPC）和进化保守性分析均支持Gm44763是一个非编码RNA，且在不同物种间具有一定保守性。
在mPFC中过表达Gm44763损害吗啡诱导的奖赏记忆
为了探究Gm44763的因果性作用，研究人员通过脑立体定位注射将过表达Gm44763的慢病毒（LV-Gm44763）导入小鼠mPFC。行为学实验发现，与对照组（LV-Control）相比，过表达Gm44763显著降低了吗啡诱导的CPP得分，即削弱了奖赏记忆的形成和提取。这种效应并非源于运动能力、焦虑水平、空间学习记忆或天然奖赏（蔗糖偏好）的改变，表明Gm44763特异性地调控药物奖赏记忆。
Gm44763过表达逆转吗啡诱导的突触重塑和神经元过度兴奋
分子水平上，Western blot结果显示吗啡暴露会上调突触后密度蛋白95（PSD-95）和囊泡谷氨酸转运体1（VGluT1）的表达，而Gm44763过表达能逆转这种变化。高尔基染色结合Sholl分析显示，吗啡处理增加了mPFC神经元的树突复杂度和总分支长度，以及树突棘密度，Gm44763过表达则使这些形态学指标恢复正常。在体光纤光度记录进一步揭示，吗啡CPP小鼠在进入药物配对环境时mPFC神经元钙信号活动增强，表现为神经元过度兴奋，而Gm44763过表达能部分逆转这种神经元超兴奋性。
构建并验证Gm44763/miR-298-5p/eIF4E调控网络
基于Gm44763的胞质定位，研究人员推测其可能通过ceRNA机制发挥作用。通过整合mRNA表达谱数据（GEO: GSE221797）和生物信息学预测，他们构建了一个以Gm44763为核心的ceRNA网络，其中miR-298-5p和其靶基因eIF4E（真核翻译起始因子4E）被重点关注。qPCR验证显示，在吗啡CPP小鼠mPFC中，miR-298-5p表达上调，而eIF4E mRNA表达下调。RIP实验证明Gm44763和eIF4E均能与Ago2蛋白结合，表明它们都是RISC复合物的组成部分。双荧光素酶报告基因实验和FISH共定位分析证实了Gm44763与miR-298-5p、以及miR-298-5p与eIF4E 3‘UTR区域的直接结合。在神经元细胞系（N2a）中的挽救实验表明，Gm44763过表达可降低miR-298-5p水平，从而解除其对eIF4E的抑制，上调eIF4E的mRNA和蛋白表达；而人为过表达或抑制miR-298-5p可相应地下调或上调eIF4E，且Gm44763能逆转或增强这些效应。
miR-298-5p双向调控吗啡诱导的奖赏记忆
在体实验表明，通过antagomir抑制mPFC内miR-298-5p的表达，可损害吗啡奖赏记忆；反之，通过AAV过表达miR-298-5p则增强奖赏记忆。更重要的是，共表达AAV-miR-298-5p和LV-Gm44763发现，miR-298-5p过表达可逆转Gm44763过表达对CPP行为以及eIF4E表达的抑制作用。光纤记录结果也显示，miR-298-5p过表达加剧了吗啡诱导的神经元超兴奋，而Gm44763共表达可减弱此效应。这些结果证明miR-298-5p是Gm44763下游的关键效应分子，双向调控奖赏记忆。
eIF4E介导的翻译调控参与吗啡诱导的奖赏记忆
研究进一步深入探讨下游效应分子eIF4E的功能。蛋白质相互作用（PPI）网络和GO分析提示eIF4E相关蛋白富集于突触翻译调控等过程。实验发现，尽管吗啡暴露降低了mPFC中总eIF4E蛋白水平，但其Ser209位点的磷酸化（p-eIF4E）水平显著升高。IP实验证实吗啡增强了eIF4E与eIF4G的相互作用，同时减弱了其与4E-BP的结合。SUnSET assay显示吗啡处理提高了mPFC的整体蛋白质合成速率，而Gm44763过表达则降低此速率。在细胞模型中，使用eIF4E/eIF4G相互作用的选择性抑制剂4EGI-1，可有效阻断eIF4E-eIF4G结合并抑制蛋白质合成。行为学上，侧脑室注射4EGI-1可损害吗啡CPP，且与Gm44763过表达具有协同抑制效应。同时，4EGI-1处理也降低了mPFC中多种突触可塑性相关蛋白（如PSD-95, Syn1, VGluT1, SYP）的表达。
本研究首次系统描绘了吗啡CPP小鼠mPFC的lncRNA表达谱，并鉴定出Gm44763作为关键调控分子。研究结果揭示了一条全新的Gm44763/miR-298-5p/eIF4E调控轴：吗啡暴露导致mPFC神经元中Gm44763表达下调，解除其对miR-298-5p的海绵吸附作用，从而增强miR-298-5p对eIF4E的抑制，最终影响eIF4E介导的蛋白质翻译过程。这一过程调控了突触结构和功能的可塑性变化（如树突复杂性、 spine密度、神经元兴奋性），从而参与吗啡奖赏记忆的形成和维持。该研究不仅深化了对成瘾记忆分子机制的理解，将非编码RNA、microRNA和翻译调控联系起来，而且为开发针对物质使用障碍的新的治疗策略（例如靶向Gm44763/miR-298-5p/eIF4E轴）提供了潜在的分子靶点。未来的研究可进一步探索该通路在不同成瘾药物、不同性别以及成瘾不同阶段（如戒断、复吸）中的普适性和特异性，并利用翻译组学等技术精确解析eIF4E调控的具体下游靶标mRNA。
