《Journal of Virology》：In vitro and in vivo characterization of a novel HSV-1 H129 neurotracer recombinant reveals dose-dependent replication and spread dynamics
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本文系统报道了新型复制缺陷型HSV-1 H129-dTK（胸苷激酶缺失）重组神经示踪病毒的构建与功能验证，通过引入mNeonGreen（mNG）荧光蛋白与FlpO/Cre重组酶的双报告系统，在体外（分室神经元培养）和体内（转基因报告小鼠）模型中揭示了其剂量依赖性的复制、标记及跨突触传播特性，为降低神经毒性、实现精准神经环路示踪提供了重要工具与理论依据。
ABSTRACT
理解脑回路的组织和连接性几十年来一直是神经科学的主要焦点，病毒载体已被普遍用于动物模型中的神经连接图谱绘制。α-疱疹病毒（α-HV）1型单纯疱疹病毒（HSV-1）因其在神经系统中的双向传播能力以及对病毒胸苷激酶（TK）基因在终末分化神经元中复制的依赖性，成为研究最深入和基因修饰最多的病毒之一。H129是HSV-1的一个脑部分离株，是应用最广泛、最有前景的顺行神经示踪剂，用于绘制神经元投射图谱。复制缺陷型单突触H129载体（H129-dTK）先前已被开发。本研究中，我们报告了一种新型H129-dTK重组病毒的开发和表征，该病毒表达mNeonGreen以及FlpO重组酶。我们利用分室化原代神经元培养和FlpO/Cre报告基因小鼠系研究了该重组病毒的复制和传播特性。我们的发现揭示，H129-dTK重组病毒的复制、标记和传播表型强烈依赖于病毒的感染剂量。在较高病毒剂量下，H129-dTK表现出有限的复制和顺行跨突触传播，且不需要外源性TK互补，这可以通过Cre/FlpO报告基因小鼠进行可视化。这种受控的复制减少了注射部位的组织损伤，同时允许精确标记神经元的输出投射。总之，这些结果为理解复制缺陷型H129重组病毒在神经元中体外和体内的复制和传播特性提供了宝贵的见解，支持基于H129的神经示踪剂的进一步发展。
INTRODUCTION
哺乳动物神经系统拥有复杂的神经网络回路。理解这些回路的组织和连接性几十年来一直是神经科学的主要焦点。病毒载体已被用于绘制动物模型中的神经回路连接。在这些病毒示踪剂中，α-疱疹病毒（α-HV）1型单纯疱疹病毒（HSV-1）是研究最多和操作最多的病毒之一。α-HV是大型双链DNA病毒，具有复杂的皮层和脂质包膜。它们能在生产性感染期间编码70-200个基因，每个受感染细胞产生数百个子代病毒。α-HV主要侵入外周神经系统建立终身潜伏感染，但感染可通过跨越多个突触传播到高阶神经元，从而扩散到中枢神经系统。有趣的是，α-HV在神经系统中可以双向传播，从突触前神经元到突触后神经元（顺行），或从突触后神经元到突触前神经元（逆行）。由于这些跨突触传播特性，α-HV已被用于体内追踪神经回路。
HSV-1能够感染包括灵长类、啮齿类和兔子在内的各种动物模型，这使其成为绘制神经元回路图谱的宝贵工具。这是通过利用病毒通过称为跨突触传播的过程在突触连接的神经元链中传播的能力来实现的。α-HV在其双向传播方面是独特的，这依赖于不同的微管马达的逆行和顺行运输机制。在细胞核中病毒复制和衣壳组装后，病毒粒子在反式高尔基体样膜中进行二次包膜，产生包含在胞质囊泡内的成熟病毒粒子，准备从突触前神经元向突触后神经元（顺行）或从突触后神经元向突触前神经元（逆行）传播。由于顺行传播需要专门的轴突分选机制，许多其他嗜神经病毒（例如狂犬病病毒）主要进行逆行传播。虽然也有其他病毒可以顺行传播的例子，但它们的分选和传播机制尚不清楚。对于α-HV，顺行传播机制涉及三种病毒包膜蛋白（gE/gI/Us9）及其与神经元驱动蛋白的相互作用。
HSV-1患者分离株H129是从一名病毒性脑炎患者的大脑中分离得到的。H129在中枢神经系统中显示出显性的顺行分选表型，尽管这种分选偏好的机制尚未确定。表达荧光蛋白的重组H129神经示踪病毒主要标记受感染神经元的输出，因此已被用作神经回路示踪剂。尽管基于H129的重组病毒是最有前景的顺行示踪剂之一，但存在一个矛盾的挑战：H129在脑中的复制虽然增强了标记强度，却会导致神经元毒性并在短时间内导致受感染动物死亡，从而限制了回路分析研究。
为了克服这一限制，通过条件性表达或删除H129基因组中的病毒胸苷激酶（TK）基因，产生了复制缺陷型单突触H129重组病毒。TK通过催化胸苷磷酸化合成胸苷一磷酸，这是病毒DNA聚合酶将其掺入增长DNA链的关键步骤。在增殖细胞中，内源性TK可以补偿病毒TK的缺陷，从而允许病毒复制。然而，在非增殖细胞，特别是神经元中，细胞TK活性非常低。这强烈减弱了病毒基因组复制，从而阻止了H129-dTK在相连神经元间的传播。表达TK的辅助腺相关病毒（AAV）已被用于在神经系统中互补这些病毒的复制，以恢复病毒复制、释放和跨突触传播。然而，恢复的复制会在短时间内导致神经元死亡。
在本研究中，我们通过检查双报告基因病毒的剂量依赖性复制和表达动力学，解决了与H129复制依赖性基因表达和传播相关的毒性问题。我们构建了三种新型神经示踪重组病毒：H129-dTK-mNeonGreen-P2A-FlpO（亮Flp；H129-BF）、H129-dTK-mNeonGreen-P2A-Cre（H129-Cre）和H129-dTK-LSL-mNeonGreen-P2A-FlpO（暗Flp；H129-DF）。当应用于表达Cre或Flp依赖性荧光蛋白的转基因报告基因小鼠模型时，这些双报告病毒能够直接（通过复制依赖性荧光蛋白表达）或间接（通过重组酶介导的内源性报告基因激活）进行神经元标记。mNeonGreen（mNG）是一种强荧光蛋白，但其检测需要与病毒复制相关的丰富表达。相比之下，Cre和Flp重组酶即使在低表达水平下也能激活靶细胞中的内源性荧光蛋白表达。基于此，我们假设重组酶介导的内源性报告基因表达即使在TK缺失导致H129复制减弱且没有表达TK的辅助AAV的情况下，也能实现神经元标记。
我们的结果表明，H129-dTK重组病毒能够在没有TK互补的情况下在原代皮层神经元（CNs）中复制，尽管病毒产量降低。我们在分室化原代神经元培养模型中，在高和低感染复数（MOI）下，表征了H129-BF在逆行（轴突到胞体）和顺行（胞体到轴突）感染过程中的感染和基因表达动力学。H129-BF的逆行感染效率显著降低，特别是在低剂量轴突感染时，而顺行感染显示出剂量依赖性的复制和传播效率。我们进一步在两种不同的报告基因小鼠模型中测试了H129-BF的传播和标记动力学。当H129-BF的复制被辅助AAV载体互补时，Flp报告基因和mNG表达均增加，导致广泛的感染和顺行传播，并在5天内在注射部位引起组织损伤。有趣的是，Flp介导的内源性报告基因表达显示出与病毒编码的mNG不同的动力学，有效地将神经元标记与病毒复制效率解耦联。最后，我们发现即使没有TK反式互补，H129-BF感染在小鼠大脑中也表现出剂量依赖性的复制和传播。在适当的剂量下，这可以有效地标记对侧部位的突触后神经元，同时避免注射（同侧）部位出现显著的组织损伤。
RESULTS
Construction of new recombinants
我们通过同源重组在Vero或Vero-Cre细胞中，同时删除病毒TK基因并将其编码序列替换为（i）mNeonGreen-P2A-FlpO，（ii）mNeonGreen-P2A-Cre，或（iii）一个Cre依赖性的loxP-STOP-loxP（LSL）-mNeonGreen（mNG）-P2A-FlpO盒，构建了三种新的复制缺陷型和条件性/组成型表达重组酶的H129重组病毒。纯化的H129野生型（wt）与线性化的载体质粒共转染到宿主细胞中。在Ara-T选择下分离H129重组病毒，并使用PCR和Western blotting方法进行验证。将所得的重组病毒命名为：H129-dTK-mNG-P2A-FlpO为“H129-BF（亮Flp）”；H129-dTK-mNG-P2A-Cre为“H129-Cre”；H129-dTK-LSL-mNG-P2A-FlpO为“H129-DF（暗Flp）”。病毒TK蛋白表达仅在wt H129感染的细胞裂解液中检测到，而HSV-1结构蛋白表达在H129和所有三种重组病毒感染裂解液之间具有可比性。
用wt H129和三种新重组病毒感染分离的颈上神经节（SCG）神经元，在感染后24小时（24 hpi），在H129-BF和H129-Cre感染的神经元胞体的细胞质和细胞核中检测到mNG表达。正如预期，在MOI为1感染Vero细胞24小时后，所有三种重组病毒的细胞相关（CA）或上清液（SN）病毒产量与wt H129相当。
Characterization of viral replication in primary CN culture
H129-dTK突变体在神经系统中的复制缺陷已在动物模型中显示，但它们在神经元培养模型中的复制尚未得到很好的表征。为了比较新H129-dTK重组病毒与wt H129的复制效率，我们以MOI为1感染从E17大鼠胚胎分离的CNs，并在48 hpi测定病毒产量。与wt H129相比，我们观察到H129-BF、H129-DF和H129-Cre的病毒滴度平均分别降低了7.3倍、3.3倍和8.7倍，表明TK缺失的H129重组病毒在培养的CNs中保留了复制能力，尽管效率较低。
Dose-dependent retrograde infection dynamics of H129-dTK-BF in compartmented SCG cultures
为了表征H129-dTK突变体的定向传播，我们感染了在改良的Campenot小室（即三室）中培养的原代SCG神经元。对于逆行感染实验，在仅包含轴突的N室中以1、10或100 MOI的wt H129或H129-BF重组病毒感染神经元。72小时后，在100、10和1 MOI的wt H129感染中，病毒产量分别达到1.5 × 105、3.9 × 104和3.6 × 104pfu/mL。相比之下，在1 MOI的H129-BF感染中，72 hpi时在S室未检测到病毒。当轴突室以10 MOI的H129-BF感染时，我们在不同生物学重复的S室中观察到可变的结果，从无检测到的病毒（ND）到非常低的滴度，表明有效复制的阈值接近10 MOI，低于此值则复制起始变得低效。总体而言，在此MOI下，H129-BF在S室的病毒产量与wt H129相比显著降低（平均降低695.7倍）。在100 MOI时，H129-BF产生4 × 103pfu/mL的子代病毒，平均比wt H129降低了37.5倍。这些发现表明，与wt H129病毒相比，H129-TK缺失重组病毒的逆行感染效率和/或复制受损。
Anterograde spread dynamics of H129-dTK-BF in compartmented SCG cultures
为了进一步表征H129-dTK突变体的传播动力学，我们在分室化原代SCG培养物中进行了顺行传播实验。如上所述，神经元在三室中培养。对于顺行传播实验，在S室（胞体和轴突一起）以1、10和100 MOI感染神经元。在仅包含轴突的N室中接种Vero细胞，以监测wt H129和H129-BF的顺行分选和传播效率。在72 hpi时收获S室和N室用于病毒产量分析。在72 hpi时，wt H129感染的神经元在S室的病毒产量显著高于H129-BF感染的神经元，在1和10 MOI时分别有48.8倍和68.7倍的平均差异。有趣的是，在100 MOI感染时，H129-BF的滴度比wt H129高约2.1倍，可能是由于此时wt H129感染的神经元死亡。wt H129和H129-BF感染的N室的滴度在72 hpi时具有可比性。由于TK缺失的H129重组病毒在Vero细胞中没有显示出任何复制缺陷，我们得出结论，wt和突变体H129病毒在Vero细胞中的复制和传播在72 hpi时达到平台期。
我们还通过监测在24、48和72 hpi时，MOI为1、10和100的情况下mNG的积累，检查了H129-BF感染在胞体（S）和轴突（N）室中的复制和传播动力学。在1 MOI时，24 hpi未观察到可检测的mNG信号，但到48 hpi时荧光开始积累，并与向N室的初始传播同时发生。10 MOI感染在24 hpi时显示稀疏的mNG阳性神经元，有限的N室传播在48和72 hpi时变得广泛。在100 MOI时，从24 hpi起在S室和N室均观察到强烈的mNG表达，荧光强度在72 hpi期间显著增加。这些结果证明了H129-BF在原代神经元中明显的剂量依赖性复制和顺行传播动力学。
H129-BF replication, Flp expression, and transsynaptic spread in the absence and presence of helper AAV in vivo
为了检查H129-dTK在体内的复制和基因表达动力学，我们在存在或不存在表达TK的辅助AAV的情况下，用H129-BF感染双Cre/Flp报告基因小鼠。Emx1-Cre小鼠在Emx1启动子控制下在一部分兴奋性神经元中表达Cre重组酶。Ai65D报告基因系包含一个tdTomato（tdT）基因，其下游有两个转录STOP盒：一个侧翼为FRT位点，另一个侧翼为LoxP位点。将Emx1-Cre和Ai65D小鼠杂交产生双转基因Ai65D；Emx1-Cre双报告基因小鼠。在这些小鼠中，tdT表达需要Flp和Cre介导的重组，其中Cre在确定的兴奋性神经元亚群中表达。
我们将H129-BF立体定位注射到双报告基因小鼠的初级视觉皮层（V1）。另一组小鼠在H129-BF感染前10天接受在Cre控制下表达TK和iRFP的辅助AAV病毒（AAV-DIO-TK-EF1a-TK-T2A-iRFP）。H129-BF注射五天后，对小鼠进行灌流，大脑固定并进行组织学分析。注射部位的比较显示，当通过辅助AAV反式提供TK时，H129-BF的复制和传播（由病毒mNG信号指示）显著增强。然而，这些部位的强健病毒复制导致了局部组织损伤。
在注射部位，我们确定了三个不同的神经元群体：（i）一小部分同时表达Cre和H129-BF来源的Flp重组酶，显示tdT和mNG共表达；（ii）少数明亮的tdT阳性神经元缺乏mNG信号；（iii）大量mNG阳性神经元具有弱的tdT标记。这些发现表明，报告基因激活的动力学在宿主编码的tdT（由Flp重组酶激活）和病毒编码的mNG报告基因之间不同。我们假设在感染早期，低水平的病毒Flp表达足以诱导强健的tdT产生，而mNG表达仍接近或低于检测水平。在复制中期，可以同时检测到tdT和mNG。随着病毒复制的进展，宿主翻译逐渐被抑制，减少了tdT表达，而病毒mNG继续积累。
在对照皮层检测到H129-BF的顺行跨突触传播，以同时表达tdT和mNG的神经元为标志。值得注意的是，在对侧部位，tdT阳性神经元的数量超过了mNG阳性细胞。我们确定了代表不同感染阶段的三个群体：双tdT/mNG阳性神经元、单mNG阳性神经元和单tdT阳性神经元。重要的是，在没有辅助AAV的情况下进行H129-BF感染，导致注射部位病毒复制有限，组织损伤最小。我们观察到少量双tdT/mNG阳性神经元和少数仅表达mNG的神经元，而大多数仅为tdT阳性。值得注意的是，即使没有辅助AAV，H129-BF也表现出向对照皮层的顺行传播，由tdT表达证明。在这个部位，来自病毒基因组的mNG荧光几乎检测不到，这与通过Cre和Flp介导的重组早期激活tdT一致。在未接受任何病毒注射的对照动物中，未检测到组织损伤或荧光蛋白表达。这些发现表明，未检测到病毒编码的荧光蛋白并不一定意味着缺乏感染或传播；相反，病毒基因表达可能低于检测阈值，但足以产生Flp重组酶并诱导tdT表达。
Dose-dependent H129-BF replication and transsynaptic spread without helper AAV in vivo
为了进一步检查在没有辅助AAV的情况下H129-BF的复制和传播动力学，在初级视觉皮层（V1）向Ai65F小鼠注射两种剂量的H129-BF：2 × 105pfu和1 × 105pfu。Ai65F小鼠响应Flp重组酶活性表达tdTomato（tdT）。注射后5天对小鼠进行灌流，大脑进行处理用于免疫组织学分析。在没有辅助AAV的情况下，注射部位未观察到组织损伤，证明了H129-ΔTK突变体在体内有限的复制能力。
有趣的是，注射较低剂量的小鼠在注射部位显示出广泛的tdT表达，只有少数神经元显示单mNG或双tdT/mNG表达。在这个剂量下，仅在对侧皮层检测到tdT阳性神经元。这些结果与我们体外和体内的发现一致，表明H129-BF在缺乏TK的情况下保留了减毒的复制。由于这种减弱，病毒mNG表达有限且通常低于检测限，而内源性tdT报告基因显示出强健的标记，因为只需要少量病毒Flp表达即可激活神经元tdT表达。即使低剂量的H129-BF感染也能标记对侧皮层中顺行连接的神经元，仅通过tdT表达即可检测到。
注射较高剂量的小鼠在注射部位表现出更多数量的双tdT/mNG阳性神经元。在这个剂量下，我们还观察到广泛的单tdT或mNG阳性神经元，反映了病毒感染的不同阶段。与较高的初始病毒剂量相关的增加复制潜力导致了对侧皮层更广泛的标记，包括一些双阳性神经元和许多tdT阳性神经元。
DISCUSSION
神经解剖学研究中最广泛使用的多突触示踪剂之一是HSV-1患者分离株H129，它表现出强烈的顺行传播偏好。H129的基因组已完全测序，但导致其顺行偏好的具体基因突变仍不清楚。研究表明，逆行传播的缺陷可能是由于影响病毒从胞体-树突区域释放的多个基因突变，促进了子代病毒粒子的优先轴突运输和释放。在过去的二十年中，已经开发了各种荧光标记的H129示踪剂，其中许多是组成型复制或条件控制下复制，能够在单突触和多突触追踪研究中精确绘制神经回路图谱。
然而，H129及其衍生物在神经系统中的复制通常导致神经元死亡，这是回路追踪研究中的一个显著缺点。毒性主要归因于病毒DNA复制和病毒蛋白的过度表达。为了减轻这一点，已经开发了具有TK缺失的H129示踪剂。由于TK对DNA复制至关重要，并且其在终末分化神经元中的表达极低，TK缺失减慢了病毒在神经系统中的复制。虽然这种策略降低了细胞毒性，但也限制了荧光基因表达，并且通常需要通过AAV转导互补TK基因，这引入了额外的复杂性和挑战，包括持续的神经元死亡。
在本研究中，我们设计并构建了新型H129-dTK重组示踪剂，从TK位点表达mNeoGreen-P2A-FlpO/Cre，能够以更低的毒性更精确地操纵神经回路。虽然先前的工作表明TK缺失的HSV-1毒株在神经系统中的复制严重受限，但我们的发现表明，在某些神经元亚型中，特别是在较高剂量（即MOI）启动感染时，复制仍然可以发生。我们在培养的SCG和CNs以及体内小鼠模型中观察到剂量依赖性的复制。这种剂量依赖性的复制能力与TK并非神经系统病毒持久性所必需的研究结果一致。这些结果强调，如果以足够的病毒剂量感染，TK缺失的病毒仍然可以在终末分化神经元中复制。在追踪研究中必须仔细考虑感染病毒剂量（即病毒滴度），因为该参数影响传播效率和动物的存活率。神经元对病毒感染的允许性和易感性的变异性进一步影响感染动力学，因为某些神经元群体可能更容易或更不容易受到病毒感染。
当我们通过轴突感染SCG神经元时，观察到感染动力学最显著的差异。以MOI为1启动的轴突感染导致在SCG的胞体室中未检测到病毒子代，表明在这些条件下逆行运输和/或建立潜伏感染效率低下。然而，将MOI增加到10和100分别导致一半样品和所有样品中产生生产性感染，尽管产量较低，这支持了以下假设：复制效率是剂量依赖性的，并且与wt H129病毒相比，H129-dTK突变体的轴突进入、逆行运输和生产性周期起始效率较低。可能多种病毒和宿主因素导致了这种逆行感染缺陷，这需要进一步的机制研究。
尽管
