《Microbiology Spectrum》：Transcription-based comparison of Aggregatibacter actinomycetemcomitans or Porphyromonas gingivalis-induced experimental periodontitis
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本研究通过RNA测序（RNA-seq）技术，在小鼠实验性牙周炎模型中比较了伴放线放线杆菌（Aa）和牙龈卟啉单胞菌（Pg）诱导的宿主转录组差异。研究发现两种病原体激活了不同的差异表达基因（DEGs）和信号通路，但共享22个核心DEGs，其中12个与体液免疫相关。基因共表达网络分析揭示了八个功能模块，并构建了基因调控网络（GRNs），鉴定出FOS、JUN、RELA、TP53、EGR1和NFκB1等六个在人类网络中保守的主调控转录因子（MR-TFs），为理解牙周炎发病机制和开发靶向治疗策略提供了新见解。
ABSTRACT
牙周炎是一种由宿主对龈下菌斑生物膜失调的免疫反应失衡引起的慢性炎症性疾病。在受感染的牙周组织中检测到的革兰氏阴性菌中，伴放线放线杆菌（Aa）和牙龈卟啉单胞菌（Pg）与最具破坏性的牙周炎形式密切相关。鉴于它们的系统发育分化和独特的毒力潜能，研究团队在分别直接接种Aa和Pg诱导的小鼠实验性牙周炎模型中进行了比较转录组分析。在确认牙周组织破坏后，对构成受牙周炎影响组织一部分的腭粘膜进行了大规模RNA测序（RNA-seq）。分析鉴定出91个响应Aa的差异表达基因（DEGs）和119个响应Pg的DEGs，其中仅有22个共享的DEGs，其中12个与体液免疫反应相关。比较分析揭示了八个不同的共表达模块，每个模块表现出不同的基因组成和表达模式。值得注意的是，与免疫反应相关的模块4在两种细菌感染下显示出相似的表达谱。此外，研究团队从转录组数据构建了基因调控网络（GRNs），并识别出一个包含8个簇、54个节点、17个转录因子和53个调控相互作用的子网络。最后，转录因子FOS、JUN、RELA、TP53、EGR1和NFκB1被确定为接种诱导的小鼠牙周炎的主调控因子（MR-TFs），并且在人类调控网络中保守。
IMPORTANCE
牙周炎是人类中最常见的骨溶解性疾病，显著影响口腔健康并加剧各种全身性炎症状况。在严重病例中经常发现特定的细菌，如Aa和Pg。这凸显了需要采用先进的方法来理解其潜在的致病机制。研究团队首次使用大规模RNA-seq分析了受或未受两种细菌最强毒力血清型诱导的实验性牙周炎影响的动物的完整腭粘膜。研究结果表明，这些细菌利用不同的分子途径诱导疾病。尽管存在系统发育差异和独特的毒力因子，Aa和Pg激活了共同的转录调控因子，这些因子促进牙周炎进展，提示了牙周破坏背后存在保守的分子机制。这些结果为开发治疗策略以调控这些调控节点并改善牙周炎及其他相关炎症状况的治疗效果提供了宝贵信息。
INTRODUCTION
牙周炎是最普遍的人类骨溶解性病理，是一种慢性、非传染性炎症疾病，会逐渐破坏牙周组织。其临床表现包括牙龈炎症、临床附着丧失、牙槽骨吸收、牙周袋形成，并最终导致牙齿丧失。牙周炎与其他全身性炎症状况密切相关，并可影响其进程，这些状况包括类风湿性关节炎、骨质疏松症、II型糖尿病、阿尔茨海默病、心血管疾病和不良妊娠结局。牙周炎的主要病因是失调的龈下生物膜引起的持续挑战，这触发了失调的宿主免疫反应，从而驱动疾病表型。
某些具有致病潜力的细菌物种与牙周炎的发生、进展和严重程度相关。虽然这些细菌可以直接损伤牙周组织，但不可逆破坏的主要驱动因素是针对它们引发的宿主免疫反应。其中关联最强的牙周病原体包括牙龈卟啉单胞菌（Pg），一种厌氧、非糖解的革兰氏阴性杆菌，和伴放线放线杆菌（Aa），一种嗜二氧化碳、兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌。它们与破坏性牙周炎的关联得到了其毒力特性、在患病牙周组织中的反复检测以及在牙周健康组织中罕有检测的支持。基于荚膜抗原异质性，Pg被分为六种血清型（K1–K6），可分为侵入性（荚膜）和非侵入性（非荚膜）菌株，其中K1血清型毒力最强。相应地，Aa根据其脂多糖（LPS）组成分为七种血清型（a–g），其中b血清型最常与严重牙周炎相关。
尽管它们都与牙周破坏相关，但Pg和Aa在系统发育上无关，并表现出不同的毒力机制，使它们能够定植于龈沟，浸润结合上皮，侵入并扩散通过结缔组织，调节宿主免疫反应，并诱导病理性牙槽骨丧失，这是牙周炎的标志。虽然其致病性的一些分子机制已被阐明，但对参与其致病策略的特定基因、信号通路和宿主基因调控网络（GRNs）的全面比较分析仍不完整。这一知识差距限制了旨在减缓疾病进展的靶向治疗方法的开发。
鉴于腭粘膜是保护性牙周组织的重要组成部分，负责保护牙槽骨和牙周韧带免受微生物侵袭，研究团队先前的研究表明，对整个腭粘膜进行转录组分析（Bulk RNA-seq）可以全面表征小鼠结扎诱导牙周炎模型中与牙周炎症相关的分子变化。在该工作中，研究团队识别出408个主要与宿主免疫反应相关的差异表达基因（DEGs），以及26个参与牙周炎发病机制的主调控转录因子（MR-TFs）。然而，结扎模型的一个关键限制是Pg和Aa并非小鼠口腔微生物群的天然组成部分，因此不参与小鼠牙周炎的发生。因此，尽管结扎模型有效地模拟了人类牙周炎中观察到的炎症损伤，但它不能完全捕捉这些特定病原体引发的免疫反应的变化。为了解决这一局限性，研究团队开发了一种实验性牙周炎模型，将Pg和Aa的最强毒力血清型直接接种到小鼠牙周组织中。
鉴于它们不同的系统发育背景，研究团队假设Pg和Aa会通过不同的转录途径和调控机制诱导牙周炎。在此，研究团队利用高通量RNA-seq对小鼠牙周病变进行了比较转录组分析。这种方法能够识别基因表达模式、信号通路和调控这些细菌致病策略的转录调控因子。
RESULTS
Periodontitis induction and assessment of alveolar bone loss
研究团队使用小鼠实验性牙周炎模型来识别Aa和Pg驱动疾病所激活的基因和信号通路。该模型基于将这些细菌直接接种到牙周组织中。由于牙槽骨丧失是牙周炎的一个标志，研究团队使用微型计算机断层扫描（micro-CT）分析了感染和未感染小鼠的上颌磨牙。感染小鼠的骨体积测量（μm3）在3D重建后显示，与未感染的对照小鼠相比，牙槽骨丧失显著更高。牙周炎小鼠在接种后30天表现出骨丧失，具体位于釉质牙骨质界和牙槽嵴顶之间，以及第一磨牙近中面和第三磨牙远中面之间。这些结果表明实验性牙周炎被成功诱导。
Global expression patterns and DGEs analysis in experimental periodontitis induced by the inoculation of A. actinomycetemcomitans or P. gingivalis
随后，研究团队进行了RNA-Seq以检查未感染和受牙周炎影响小鼠牙周组织中的转录变化。为了实现目标，研究团队从所有三个实验组提取了完整的口腔腭粘膜样本。选择该组织是因为腭粘膜是覆盖硬腭和部分软腭的特化上皮衬里。它具有坚固的角化表面，作为抵御牙周病原体的重要机械和生物屏障。组织架构包含多种在牙周反应中起重要作用的细胞类型，包括角质形成细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、成纤维细胞、先天性和适应性免疫细胞以及骨细胞，如成骨细胞和破骨细胞。该粘膜的完整性、炎症反应和防御能力对于管理牙周损伤至关重要。因此，分析该组织为研究牙周炎发病机制中涉及的细胞、免疫学和结构反应及机制提供了生物学相关模型。
全局转录变化揭示了91个响应Aa接种的DEGs和119个响应Pg接种的DEGs。对于此分析，仅考虑那些在牙周炎小鼠与健康小鼠相比满足p.adj < 0.05显著性水平且倍数变化 > 1.0的基因作为差异表达。根据这些标准，响应Aa接种鉴定出75个上调基因和38个下调基因。相比之下，Pg接种导致56个上调基因和85个下调基因。此外，当比较实验性牙周炎组与健康对照组时，维恩图显示了22个共享的DEGs。这些基因与T细胞凋亡的间接调控（Art2a）；炎症和组织重塑（Prss35和Serpina3f）；细胞骨架结构和功能（Nphs1、Stmn3、Krt2和Krt90）；以及神经元形态发生和可塑性（Prss35、Nyap2和Jph4）相关。最具代表性的功能是体液免疫反应，涉及12个编码免疫球蛋白重链的DEGs（Igkv、Ighv和Ighg）。
使用热图分析了样本间的生物学变异性，从而能够识别层次聚类和不同实验组中蛋白质编码DEGs的表达水平。这种方法清晰地区分了健康小鼠与Aa或Pg诱导牙周炎小鼠之间的基因表达模式，特别是在22个共享基因中。值得注意的是，这22个由Aa和Pg诱导接种模型共享的DEGs在两种条件下显示出一致的表达模式。特别是，与未感染对照组相比，基因Prss35、IgKv7-33、Nyap2、Krt2、Jph4和Stmn3在两种感染模型中均持续下调。相反，基因IgKv4-72、IgKv-7、IgKv1-110、Ighv1-9、IgKv12-41、Ighv3-6、Ighv11-2、Serpina3f、Gm49839、Nphs1、Art2a、Krt90、Ighg3、Ighv9-1、IgKv4-61和IgKv19-93在两种接种条件下与未感染对照相比均上调。
为了进一步探索这些转录本差异表达背后的功能通路，研究团队进行了基因本体（GO）术语富集分析。该分析强调了在Aa诱导的牙周炎中，与细胞外基质重塑和功能、免疫反应和细胞活化相关的功能术语的过度呈现。相比之下，Pg诱导的牙周炎主要激活与细胞分裂、核有丝分裂事件和大分子代谢过程相关的信号通路。此外，虽然程度较轻，但也观察到与细胞外基质蛋白合成相关的通路。总之，这些结果突出了Aa和Pg触发的不同但一致的分子反应，表明每种病原体激活特定的疾病机制。此外，观察到的共同调控基因子集的趋同性表明，尽管毒力策略不同，两种细菌都参与了宿主炎症和免疫反应的核心通路。
Gene co-expression networks during microbial inoculation-induced periodontitis
模块化基因共表达网络提供了一个系统水平的框架来理解转录组的功能组织。基因共表达网络定义为根据其表达水平在样本间的相关程度连接的一组基因。因此，当两个基因的表达谱相似地变化时，它们被认为是“共表达的”。这种相关结构使得能够将基因分组为高度互连的模块，这些模块通常对应于共享的生物学过程、协调的转录调控或参与共同的分子通路。使用这种方法，研究团队对数据集中的基因进行了功能分类，并识别了每个模块内具有潜在调控作用的基因，这对于理解所研究病理中的基因相互作用和调控机制至关重要。
为此，研究团队使用了CEMiTool，输入一个整合了三种实验条件（未感染小鼠、Aa感染小鼠和Pg感染小鼠）的标准化基因表达计数矩阵。这种数据结构使软件能够从表达谱的联合变异推断基因模块，从而能够直接比较基线转录组和感染诱导的转录变化。三种条件的比较评估显示基因聚类成八个共表达模块（M1–M8），这些模块在代表性和表达水平上均不同。这可以通过图中圆圈（模块）的大小和颜色以及不同实验组样本间个体基因表达谱的异质动力学观察到。M1、M2、M3和M4模块是最富集的，分别有270、236、226和150个基因。
识别出的八个模块显示出与多种生物学过程相关的功能富集，这些过程涉及糖蛋白生物合成相关的结构和功能过程（M1）；横纹肌系统的分子结构和功能（M2）；细胞骨架在真核细胞运动中的纤毛和鞭毛组成、组装和功能中的作用（M3）；适应性免疫反应期间淋巴细胞的功能和分化（M4）；氧化还原过程和线粒体能量产生（M5）；脂质和类固醇酶调控及小分子代谢（M6）；动态蛋白质组装过程、有丝分裂纺锤体调控和表皮分化（M7）；以及骨代谢、生物矿化和骨骼组织组织（M8）。
在分析的模块中，与体液免疫反应相关的M4是唯一一个在Aa和Pg诱导下表现出相似上调模式的模块。相比之下，其余七个模块根据接种病原体的不同表现出相反的共表达模式。例如，模块M1、M3和M8在响应Aa时上调，而M2、M5、M6和M7下调。相反，Pg对这些相同模块表现出拮抗行为。
为了确保全面理解Aa和Pg诱导的基因共表达模式，研究团队使用CEMiTool进行了整合分析，该分析结合了标准化基因表达矩阵和经过筛选的蛋白质-蛋白质相互作用数据来计算基因相关性并构建加权共表达网络。表皮生长因子（EGF）、DnaJ热休克蛋白家族（Hsp40）成员C10（DNAJC10）、H3簇状组蛋白1（H3C1）、角蛋白8（KRT8）和乳铁蛋白（LTF）被识别为M1网络中的枢纽基因，即连接数最多的节点。核糖体蛋白L3样（RPL3L）、真核翻译延伸因子1α2（EEF1A2）、肌动蛋白α1和2（ACTA1, ACTN2）、骨骼肌（ACTA1）、细丝蛋白C（FLNC）、锚蛋白1（ANK1）和磷酸二酯酶4D相互作用蛋白（PDE4DIP）在M2网络中被识别。根据其功能代表性，在M4模块中发现的枢纽基因是CD19分子（CD19）、CD79a和CD79b（CD79a和CD79b）、LCK原癌基因，Src家族酪氨酸激酶（LCK）、钾电压门控通道亚家族A成员3（KCNA3）和ISG15泛素样修饰符（ISG15）。这些基因在先天性和适应性免疫反应中至关重要。同时，H4簇状组蛋白11（H4C11）、H4簇状组蛋白8（H4C8）、分泌磷蛋白1（SPP1）、II型胶原α1链（CL2A1）、轴蛋白2（AXIN2）和RIBC2是M8中连接最多的基因。图4、5和图S1的综合发现支持了Aa和Pg可能利用不同的分子途径达到相似病理结果的假设。
Context-specific GRNs on inoculation-induced experimental periodontitis
有证据表明，疾病并非源于单个基因的改变，而是源于连接多个组织的复杂网络中的紊乱。因此，基于网络的方法增强了我们对人类疾病潜在机制的理解。通过采用这些方法，研究团队可以阐明特定的调控相互作用，并精确定位编码与健康和疾病相关的各种细胞功能的转录因子（TFs）的基因。认识到转录因子在包括牙周炎在内的多种疾病中的重要性，研究团队利用转录组数据构建了GRNs。然后进行差异网络分析以识别调控基因转录水平的全部转录因子，揭示图中所示病理表型背后的关键相互作用。
首先，研究团队使用来自表达分析的标准化表达计数矩阵以及转录因子与其高置信度靶标的相互作用，构建了特定背景的GRNs。两个覆盖健康和疾病背景的大型网络在Aa诱导牙周炎时包含6,158个节点（包括720个TFs）和18,683条边，第二个网络在Pg引起牙周炎时包含6,159个节点（718个TFs）和18,612个连接。值得注意的是，这些网络共享6,157个基因，其中编码转录因子NK2同源框3（NKX2-3）的基因仅存在于Aa诱导的GRN中，而蛋白质编码（非TF）基因细胞色素P450家族2亚家族C成员9（CYP2C9）和血小板反应蛋白2（THB2S）仅存在于Pg的GRN中。这些图表明的主要发现是，尽管这些病原体利用不同的途径发展其病理活动，但它们在转录水平上受相同的TFs调控。
然后从这些网络创建了一个子网络，仅包含使用CEMiTool识别的八个共表达模块的节点。该子网络包含八个组及其相应的调控相互作用，包含54个节点、17个TFs和53条边。在检查的子网络中，M4是最大的节点簇，也是宿主免疫反应的中心。该模块包含19个节点，其中4个对应于TFs。值得注意的是，被识别为肌细胞增强因子2B（MEF2B）、配对框5（PAX5）、Spi-B转录因子（SPIB）和POU类2同源框关联因子1（POU2AF）的TFs在健康和疾病条件下均存在，没有DEGs或TFs是牙周炎特有的。这些转录因子与其他模块相互作用，如M1（GMDS）、M2（RYRI）和M3（RP1），并调控同一M4内的基因。
第二个最具代表性的模块是M1，有17个节点。然而，该模块因拥有最多数量的TFs而突出。在该模块中识别的10个TFs在M1内执行调控活动，并显示出与模块M2、M3和M6的调控相互作用。在M1中，具有最多调控相互作用的TF是叉头框A1（FOXA1）。它调控几个基因：M1模块中的AGR2；M6模块中的TRF；以及M3模块中的KRT7、MUC4和SFTPD。此外，FOXA1受M3模块的叉头框J1（FOXJ1）-TF调控，而FOXJ1又受M1模块的SAM Pointed Domain Containing ETS Transcription Factor（SPDEF）调控。M1模块中另一个突出的TF是ARNTL，也称为碱性螺旋-环-螺旋ARNT样（1BMAL1）。该因子调控DBP和PER2-TFs，以及同一M1模块内的CXCL5和PER3编码基因。此外，未观察到ARNTL与其他模块之间的调控相互作用。
转录因子CCAAT增强子结合蛋白β（CEBPB）和CCAAT增强子结合蛋白δ（CEBPD）是模块M5和M8的唯一代表，在各种生物学功能中起关键作用。例如，CEBPB促进成骨细胞分化和破骨细胞生成调控，有助于肉芽肿形成，并在炎症免疫反应期间激活CD4+T细胞和巨噬细胞。在我们的调控网络中，许多基因，如M1中的DMBT1和NUPR1，M3中的SFTPD，M7中的BGLAP，以及M4中的CR2、SERPINE1和CHG1，受CEBP调控。此外，它还调控M6中的HP、PCK1、ALB和SLC10A，突出了其广泛的调控能力。就其本身而言，CEBPD与由传染病触发的炎症免疫反应和IL-17家族信号通路的调控相关。该TF在我们的调控网络内调控M1中的NFIL3基因以及M6中的C3和TRF基因。
最后，M2、M6和M7不拥有TFs。因此，它们的基因受其他模块的TFs调控，如前所述。为了进一步分析数据，研究团队专注于 exclusively 与Aa或Pg诱导的牙周炎相关的节点，在子网络中以绿色和浅蓝色突出显示。选择这些基因是因为它们在局部邻近度上表现出最高的变异，通过LoTo F1度量（F1 < 0.99）测量。该度量评估当比较不同背景下的两个网络时，GRN中某个基因的邻域是否发生变化，在这种情况下是Aa或Pg诱导的牙周炎。较低的F1值表示GRNs中更显著的改变。分析识别出一个包含五个基因的子网络，其中两个是TFs，在接种Aa后。在这些TFs中，NK2同源框3（NKX2-3）值得注意，因为它仅出现在Aa相关的子网络中。该基因与炎症性肠病1和甲状腺畸形有关。同样，其旁系同源物NKX2-5在发育过程中的心脏传导中起重要作用。转录因子核因子红细胞2（NFE2）也调控基因HBB-BS、EFHB和CAMK2G，这些基因包含在两个子网络（Aa和Pg）中。相比之下，仅在Pg
