《Microbiology Spectrum》：Prevalence and genetic diversity of intestinal parasites in Xilingol League herbivores, Inner Mongolia, Northern China
ABSTRACT
肠道寄生虫是常见的传染性病原体，对牲畜的健康和生产性能产生重大影响，其中多种具有人畜共患风险。本研究在锡林郭勒盟采集了牛、羊和山羊的205份粪便样本。通过显微镜检查检测艾美耳球虫（Eimeria spp.）、线虫和吸虫，同时采用巢式聚合酶链式反应（nested PCR）鉴定十二指肠贾第鞭毛虫（Giardia duodenalis）、隐孢子虫（Cryptosporidium spp.）和比氏肠微孢子虫（Enterocytozoon bieneusi）。结果显示，草食动物肠道寄生虫总体感染率为80.5%（165/205），共感染率为47.8%（98/205）。不同宿主的感染率分别为：羊92.8%（126/139）、山羊75.0%（12/16）、牛52.0%（26/50）。艾美耳球虫、线虫、吸虫、G. duodenalis、Cryptosporidium spp.和E. bieneusi的感染率分别为59.5%、16.1%、33.7%、25.9%、7.8%和4.9%。基因分型进一步揭示了独特的优势谱系，包括G. duodenalis（集聚体B和E）、Cryptosporidium spp.（C. andersoni和C. xiaoi）以及E. bieneusi（基因型J和BEB6）。此外，艾美耳球虫感染与其他肠道寄生虫共感染的风险增加显著相关。这些发现全面概述了锡林郭勒盟草食动物肠道寄生虫的共感染情况，并凸显了寄生虫分布的显著种间差异和地区变异。
INTRODUCTION
肠道寄生虫感染是一项重大的全球公共卫生挑战，影响超过20亿人，特别是在卫生条件不足的低资源地区。这些感染主要由原生动物（如隐孢子虫、十二指肠贾第鞭毛虫、比氏肠微孢子虫、艾美耳球虫）和蠕虫（如蛔虫、带绦虫、鞭虫）引起，主要通过粪-口途径传播，并与胃肠道疾病、营养不良以及免疫缺陷患者的潜在致命后果相关。在牲畜中，肠道寄生虫损害生长性能，降低产品质量，造成巨大的经济损失，同时受感染的动物作为储存库污染环境并促进人畜共患传播。因此，对牲畜肠道寄生虫进行系统的流行病学调查对于阐明感染动态、传播模式和种群遗传多样性至关重要，从而支持可持续畜牧业、确保食品安全和保护公众健康。
肠道寄生虫感染在全球牲畜中广泛存在，在某些地区感染率通常超过70%。内蒙古，特别是锡林郭勒盟，是中国最重要的牧区之一，在约18万平方公里的草原上承载着超过1000万头放牧动物。虽然已有关于牛感染隐孢子虫和G. duodenalis的报道，但关于该地区肠道寄生虫，尤其是多物种感染的全面流行病学数据仍然有限。迄今为止，仅有一项研究记录了当地羊的线虫感染，突显了锡林郭勒放牧系统中肠道寄生虫多样性和传播风险基线信息的缺乏。
鉴于该地区开放的放牧环境和牲畜持续暴露于感染源，系统监测对于评估感染压力和传播潜力至关重要。肠道寄生虫感染经常以涉及多种寄生虫物种的共感染形式发生，这可能加剧病理结果并增加传播潜力。然而，大多数现有的区域调查侧重于单一寄生虫检测或总体感染率，对共感染动态和种间相互作用的了解有限。因此，需要进行全面系统的调查，以阐明牲畜种群中肠道寄生虫共感染的发生、相互作用和流行病学影响。
为弥补这一知识空白，本研究对来自锡林郭勒盟三个主要牧区的草食动物进行了系统调查，使用显微镜检查和巢式PCR检测艾美耳球虫、线虫、吸虫、G. duodenalis、隐孢子虫和E. bieneusi。本研究建立了该地区寄生虫流行率和遗传多样性的基线数据，并为制定有针对性的控制策略以改善牲畜生产力、确保食品安全和降低人畜共患风险提供了重要证据。
RESULTS
Epidemiological characteristics of Eimeria spp., nematodes, and trematodes
通过显微镜检查调查了锡林郭勒盟多个地点的牲畜肠道寄生虫。在检测到的寄生虫中，艾美耳球虫（Eimeria spp.）卵囊最为常见。艾美耳球虫总体感染率为59.5%（122/205），在不同宿主物种和采样区域间存在差异。跨区域来看，东乌珠穆沁旗（65.0%， 91/140）和锡林浩特市（67.4%， 29/43）的感染率最高，均显著高于苏尼特左旗（9.1%， 2/22）。宿主特异性分析显示，羊的感染率（78.4%）高于山羊（50.0%）和牛（10.0%）。在同一宿主物种内也存在区域差异，东乌珠穆沁旗羊的感染率（87.9%）显著高于锡林浩特市（67.4%）。总体而言，艾美耳球虫感染表现出明显的区域和宿主相关差异，羊的感染率最高，东乌珠穆沁旗和锡林浩特市的样本感染率最高。
显微镜检查还调查了该地区多个地点牲畜的线虫和吸虫感染。线虫卵和吸虫卵的检出率分别为16.1%（33/205）和33.7%（69/205）。线虫感染的流行率显示出相当大的区域变异，锡林浩特市的感染率最高（46.5%），显著高于东乌珠穆沁旗（7.1%）和苏尼特左旗（13.6%）。按宿主物种划分，羊的线虫感染率（28.8%）高于山羊（6.3%）和牛（0%），但无统计学显著性差异。在羊群中，锡林浩特市的感染率显著高于东乌珠穆沁旗。吸虫的感染率在各区域间相对一致，东乌珠穆沁旗（36.4%）、苏尼特左旗（31.8%）和锡林浩特市（25.6%）之间未检测到显著区域差异。在宿主物种中，牛的感染率最高（42.0%），其次是山羊（31.3%）和羊（30.9%），但这些差异无统计学意义。总体而言，线虫感染表现出明显的区域和宿主相关变异，而吸虫感染在各区域和宿主物种间保持相对一致。
综上所述，锡林郭勒盟牲畜胃肠道寄生虫感染呈现出独特的流行病学模式，艾美耳球虫、吸虫和线虫的总体感染率分别为59.5%、33.7%和16.1%。
Prevalence, phylogenetic analysis, and haplotype characterization of G. duodenalis
通过分子检测调查了锡林郭勒盟多个地点牲畜的G. duodenalis感染和遗传多样性。G. duodenalis的总体感染率为25.9%（53/205）。跨区域来看，东乌珠穆沁旗的感染率最高（30.7%），其次是苏尼特左旗（18.2%）和锡林浩特市（14.0%）。宿主特异性分析显示，山羊（54.6%）和羊（37.4%）的感染风险显著高于牛（7.9%）。在羊群中，东乌珠穆沁旗的感染率（37.4%）显著高于锡林浩特市（14.0%）。
基于β-贾第鞭毛虫（bg）基因位点的系统发育分析表明，本研究中获得的G. duodenalis序列聚集在与集聚体B和E相对应的不同进化枝中，这些序列与先前从赤峰市和内蒙古其他地区报道的菌株具有高度序列相似性。单倍型网络分析进一步揭示了单倍型组成的区域变异。主要的单倍型Hap_3（75.6%）广泛分布于所有三个区域。东乌珠穆沁旗表现出比锡林浩特市和苏尼特左旗更高的单倍型多样性，在该区域鉴定出三个不同的单倍型（Hap_1、Hap_2和Hap_3），而在锡林浩特市和苏尼特左旗仅检测到Hap_3。
总体而言，锡林郭勒盟牲畜的G. duodenalis感染表现出明显的区域和宿主相关变异，集聚体B和E是主要的基因型，Hap_3是整个研究区域最流行的单倍型。
Prevalence, phylogenetic analysis, and haplotype characterization of Cryptosporidium spp.
巢式PCR检测到锡林郭勒盟多个地点牲畜的隐孢子虫（Cryptosporidium spp.）感染，鉴定出的物种为安氏隐孢子虫（C. andersoni）和小隐孢子虫（C. xiaoi）。隐孢子虫总体感染率为7.8%（16/205），存在于牛和羊中。跨区域来看，东乌珠穆沁旗的感染率最低（2.9%），显著低于苏尼特左旗（22.7%）和锡林浩特市（16.3%）。在羊群中，东乌珠穆沁旗的感染率（5.5%）显著低于锡林浩特市（16.3%）和苏尼特左旗（40.0%）。在牛中未观察到感染率的显著区域差异。
基于小亚基核糖体RNA（SSU rRNA）基因位点的系统发育分析显示，C. andersoni和C. xiaoi聚集在两个不同的进化枝中。单倍型网络分析在本研究获得的序列中鉴定出八个单倍型。主要的单倍型是Hap_3（38.4%）、Hap_7（23.1%）和Hap_8（30.8%）。Hap_3和Hap_8在锡林浩特市和苏尼特左旗均有发现，而Hap_7仅在东乌珠穆沁旗检测到。
总体而言，C. xiaoi是锡林郭勒盟牲畜中最常检测到的隐孢子虫物种，Hap_3和Hap_8是主要的单倍型。在不同宿主种群中，感染率和单倍型分布存在显著的区域差异。
Prevalence, phylogenetic analysis, and haplotype characterization of E. bieneusi
基于序列的分子分析揭示了锡林郭勒盟多个地点牲畜的比氏肠微孢子虫（E. bieneusi）感染。E. bieneusi在牛和羊中的总体感染率为4.9%（10/205）。阳性样本在东乌珠穆沁旗检测到，感染率达到7.2%（10/140）；在苏尼特左旗或锡林浩特市未发现感染。不同宿主物种的感染率如下：牛7.9%（3/38）、山羊18.2%（2/11）、羊5.5%（5/91）。尽管感染率因宿主物种而异，但差异无统计学意义。
基于内转录间隔区（ITS）基因序列的系统发育分析显示，E. bieneusi基因型J和BEB6聚集在第2组内，这是一个主要在反刍动物中发现的谱系。结合GenBank数据库序列的单倍型网络分析共鉴定出22个单倍型。其中，本研究仅检测到2个：Hap_9，主要在东乌珠穆沁旗的山羊和羊中发现；Hap_2，仅在牛中检测到。Hap_9是东乌珠穆沁旗的主要单倍型，占检测序列的80%，并表现出明显的区域和宿主相关分布模式。
总体而言，锡林郭勒盟牲畜的E. bieneusi感染仅限于东乌珠穆沁旗，基因型多样性有限，仅有两个第2组基因型（J和BEB6），由不同的宿主相关单倍型代表。
Overall prevalence of gastrointestinal parasites in cattle and sheep from Xilingol League
流行病学分析发现锡林郭勒盟的牛和羊普遍存在肠道寄生虫感染和频繁的共感染。统计分析显示，牛和羊肠道寄生虫的总体感染率为80.5%（165/205），每个阳性样本中至少检测到以下一种寄生虫：艾美耳球虫、线虫、吸虫、隐孢子虫、E. bieneusi和G. duodenalis。观察到感染率的显著区域差异。苏尼特左旗牲畜的感染率（50.0%， 11/22）显著低于东乌珠穆沁旗（85.0%， 119/140）和锡林浩特市（79.1%， 34/43）。宿主物种和区域因素均影响寄生虫感染率。羊的感染率（90.6%）显著高于牛（52.0%）。在同一宿主物种内，东乌珠穆沁旗山羊的感染率（90.9%）显著高于苏尼特左旗（40.0%）。东乌珠穆沁旗羊的感染率（95.6%）也显著高于锡林浩特市（79.1%）。
对两种或以上寄生虫共感染的进一步分析显示，总体混合感染率为47.8%（98/205）。在牲畜种群中，30.7%（63/205）感染两种寄生虫，15.1%（31/205）感染三种，1.5%（3/205）感染四种，0.5%（1/205）感染五种。最常见的共感染类型是原虫-蠕虫共感染，在38.0%（78/205）的动物中检测到，其次是原虫-原虫（8.9%， 18/205）和线虫-线虫（0.9%， 2/205）组合。感染艾美耳球虫的牲畜其他肠道寄生虫的感染率（71.3%， 87/122）高于未感染动物（47.0%， 39/83）。统计分析表明，艾美耳球虫感染与其他肠道寄生虫共感染的概率增加相关。
总体而言，锡林郭勒盟牛和羊的肠道寄生虫共感染在所有调查区域均有发现，显示出明显的区域和宿主相关变异，其中原虫-蠕虫组合是最常见的类型。
DISCUSSION
内蒙古的特点是半游牧畜牧系统，允许大规模牲畜移动，是中国北方草原人畜共患病传播的关键生态界面。在锡林郭勒盟等自由放牧为主的地区，共享水源和公共牧场促进了粪便污染和肠道寄生虫的跨物种传播，这些寄生虫仍然是制约牲畜健康和生产性能的主要因素。尽管具有经济和公共卫生重要性，肠道寄生虫感染在区域牲畜健康计划中受到的关注有限，并且缺乏关于混合感染的全面数据。为弥补这一空白，本研究调查了锡林郭勒盟放牧牲畜中关键肠道寄生虫（G. duodenalis、Cryptosporidium spp.和E. bieneusi）的流行率和遗传多样性，从而为理解共感染动态和制定综合控制策略建立了基线。
Regional and host-specific variations in parasite prevalence
在锡林郭勒盟的牲畜中观察到胃肠道寄生虫流行率的显著区域和宿主相关差异。E. bieneusi的流行率远低于内蒙古呼伦贝尔报告的数值，表明寄生虫分布存在区域变异。与中国其他地区相比，肠道蠕虫（线虫和吸虫）的总体感染率相对较低，而艾美耳球虫和G. duodenalis的感染率明显较高。研究区域内也存在明显的空间差异。东乌珠穆沁旗和锡林浩特市的牲畜感染率持续高于苏尼特左旗。这些区域差异可能反映了影响寄生虫传播的当地气候和生态条件，包括降水、植被和牧场污染。东乌珠穆沁旗和锡林浩特市等潮湿环境可能有利于寄生虫的存活和传播，而苏尼特左旗的干旱条件可能限制其持久性。
Genetic variability of parasites across hosts and regions
分子分析证实了锡林郭勒盟牛和羊中存在G. duodenalis集聚体B和E，其中集聚体B被认为是人畜共患基因型。这一发现表明该地区G. duodenalis感染存在潜在的公共卫生风险。对于隐孢子虫，仅在牛中检测到C. andersoni，而羊和山羊仅感染C. xiaoi。内蒙古先前的研究报道了牛粪中存在C. parvum、C. andersoni、C. ryanae和C. bovis，以及羊和山羊中存在C. ubiquitum、C. andersoni和C. xiaoi，表明隐孢子虫物种分布存在区域特异性。关于E. bieneusi，基因型BEB6和J被确定为牛和羊中的主要类型，与先前在反刍动物中描述的一致。阳性样本主要在东乌珠穆沁旗发现，其中Hap_9是最常见的单倍型，表明该地区基因型多样性有限且分布局部化。
Eimeria spp. infection facilitates mixed intestinal parasitic infections
在锡林郭勒盟的草食动物中，艾美耳球虫感染与其他肠道寄生虫的共感染增加显著相关，这与在其他地方反刍动物中的发现一致。在自由放牧系统下，混合感染尤为常见，环境暴露增加了传播风险。从机制上讲，艾美耳球虫感染可能通过破坏肠道完整性和调节宿主免疫来促进继发定植。由此产生的上皮损伤和炎症可增加对额外感染的易感性，并维持慢性肠道疾病。总之，这些发现表明艾美耳球虫是混合寄生虫感染的关键诱发因素，强调了需要综合管理策略以改善牲畜健康和生产性能。
本研究揭示了锡林郭勒盟牲畜肠道寄生虫感染存在明显的宿主和区域相关模式。艾美耳球虫是最流行的寄生虫，其次是蠕虫和肠道原虫，羊的感染水平高于牛和山羊。分子分析显示G. duodenalis和隐孢子虫的遗传变异有限，但存在区域共享的单倍型。混合感染很常见，艾美耳球虫感染显著增加了与其他肠道寄生虫共感染的可能性。尽管未进行艾美耳球虫、线虫和吸虫的物种级鉴定，但研究结果全面概述了寄生虫分布和共感染动态。这些结果填补了重要的流行病学空白，并支持在放牧牲畜中采取综合的、针对物种的寄生虫控制策略的必要性。
MATERIALS AND METHODS
Collection of fecal samples
粪便样本于2021年8月1日至8月5日期间采集自内蒙古锡林郭勒盟的三个牧场：苏尼特左旗（SZ）、东乌珠穆沁旗（DW）和锡林浩特市（BY）。共获得205份新鲜粪便样本，包括139份来自羊，16份来自山羊，50份来自牛。具体而言，在苏尼特左旗，从5只羊、5只山羊和12头牛采集样本；在东乌珠穆沁旗，从91只羊、11只山羊和38头牛采集样本；在锡林浩特市，从43只羊采集样本。所有粪便样本采集后立即于4°C保存，并分装用于进一步分析。
Detection of parasite eggs using the saturated saline flotation method
采用饱和盐水漂浮法进行粪便样本中寄生虫卵或卵囊的富集和鉴定，遵循标准化方案。准确称取10克粪便样本转移至50毫升洁净烧杯中。加入20毫升饱和氯化钠溶液，用玻璃棒彻底搅拌直至均匀。将混合物通过60目不锈钢筛网过滤，滤液收集于50毫升离心管中。样本在4°C下以3,500 × g离心5分钟。弃去上层液体，剩余液体逐渐用饱和氯化钠溶液替换，直至管口形成凸液面。立即将18 mm × 18 mm的盖玻片置于液面上。2分钟后，小心垂直提起盖玻片并置于载玻片上。在光学显微镜下观察寄生虫卵。卵形态鉴定基于标准寄生虫学图谱。
Extraction of fecal DNA
使用FastDNA Stool Kit从粪便样本中提取基因组DNA。按照制造商方案处理约500毫克粪便样本。提取的DNA样本保存于-20°C以备进一步分析。
Molecular identification of intestinal protozoa using multiplex nested PCR
由于原虫包囊较小（直径2 μm–5 μm），饱和盐水漂浮法的检测灵敏度有限。为提高诊断准确性并实现基因分型，采用巢式PCR对G. duodenalis、Cryptosporidium spp.和E. bieneusi进行分子鉴定，分别靶向bg、SSU rRNA和ITS位点。每个PCR批次均包含阳性对照（先前确认的阳性样本）和阴性对照（无菌超纯水）。取5 μL第二轮PCR产物进行1.0%（重量/体积）琼脂糖凝胶电泳，使用GelstainRed染色，并在紫外透射仪下观察。阳性扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序。使用Chromas软件评估序列质量，并通过BLAST进行序列比对。E. bieneusi的基因型根据既定命名系统确定，而Cryptosporidium spp.和G. duodenalis的基因分型遵循国家指南。
Haplotype network and phylogenetic analysis
构建邻接系统发育树以分析锡林郭勒盟肠道寄生虫的遗传结构。从GenBank下载参考序列以形成比较数据集，包括基于SSU rRNA基因序列的Cryptosporidium spp.（C. xiaoi, C. bovis, C. ryanae, C. andersoni, C. canis, C. ubiquitum, C. suis, C. parvum, C. felis）；基于bg基因序列的G. duodenalis集聚体A, B, C, D, E；基于ITS基因序列的E. bieneusi。使用MEGA 11软件进行多序列比对和系统发育分析。使用Kimura双参数模型估计遗传距离，然后构建邻接系统发育树。进行1,000次重复的Bootstrap分析以评估树拓扑结构的稳健性。外群序列选择如下：C. felis用于Cryptosporidium spp.，G. duodenalis集聚体C用于G. duodenalis，E. bieneusi基因型PtEbIX用于E. bieneusi。
为实现本地菌株的进一步遗传特征，从GenBank检索参考序列，包括C. xiaoi SSU rRNA基因、G. duodenalis集聚体B bg基因和E. bieneusi ITS基因序列。使用DnaSP软件进行单倍型鉴定。使用TCS方法以95%连接限制进行单倍型网络分析。在PopART中可视化得到的单倍型网络，并对每个鉴定出的单倍型进行样本频率注释。
Statistical analysis
使用χ2检验评估组间肠道寄生虫流行率的差异。计算OR值和95% CI以评估风险因素与寄生虫感染之间的关联。所有统计分析均使用SPSS软件进行。统计学显著性设定为P < 0.05。
ACKNOWLEDGMENTS
本研究得到内蒙古自治区科技厅关键技术攻关项目（2021GG0171）、内蒙古自治区重要新发再发人畜共患病病原谱、时空分布与传播特征研究（U22A20526）、内蒙古自治区科技领军人才团队：人畜共患病防控技术创新团队（2022SLJRC0023）和国家自然科学基金青年科学基金项目（32402911）的资助。
