《Bioactive Materials》：Multifunctional polyoxomolybdate cluster loaded into hydrogel for augmented bone regeneration through synergistic immunomodulation and osteogenesis
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本研究针对骨折不愈合/延迟愈合的临床难题，开发了负载没食子酸修饰多钼氧簇（Mo-POM NCs）的结冷胶/纳米羟基磷灰石（GG/nHA）水凝胶。该材料通过清除活性氧（ROS）重塑免疫微环境、发挥广谱抗菌作用，并协同增强生物矿化，在感染性骨缺损模型中有效协调早期免疫调节与成骨过程，为骨科生物材料设计提供了新策略。
骨骼，作为人体的重要支撑结构，其自我修复能力在面对严重创伤、感染或疾病时往往显得力不从心。骨折不愈合或延迟愈合已成为骨科临床实践中一个棘手的难题。传统的治疗方法，如使用抗生素控制感染或抗炎药物缓解炎症，往往只能提供暂时的缓解，并可能伴随抗生素耐药性或延迟愈合等副作用。更为复杂的是，骨愈合是一个涉及免疫调节、血管生成、成骨分化及生物矿化等多个阶段的精密过程。其中，过度炎症反应驱动的免疫微环境失调，特别是活性氧（ROS）的过量产生，会破坏细胞代谢、促进成骨细胞凋亡并激活促炎巨噬细胞，从而严重阻碍骨再生。与此同时，细菌感染会进一步加剧局部炎症，甚至导致骨溶解。尽管现有的生物材料能够为骨缺损提供结构支撑，但大多数材料难以同时应对免疫失调和感染风险。因此，开发一种能够协同调控免疫微环境并有效抗感染的多功能生物材料，对于实现高效的骨再生至关重要。
在这一背景下，多金属氧酸盐（POMs）——一类由早期过渡金属离子（如钼、钨、钒）和氧原子构成的多金属氧簇阴离子化合物——因其可调节的结构和氧化还原活性，作为有前景的ROS清除剂而受到关注。其中，钼基多金属氧酸盐（[PMo12O40]4?, PMo12）可利用其Mo5+/Mo6+价态的可逆转变高效清除ROS。然而，POMs作为纳米药物在应用中面临靶向性差、生物相容性不佳、潜在毒性及结构不稳定等挑战。为解决这些问题，研究人员将目光投向了水凝胶载体。结冷胶（GG）是一种FDA批准的可形成可注射水凝胶的阴离子多糖，具有良好的生物相容性和可调节的孔隙率，但其机械强度较差且骨诱导性有限。纳米羟基磷灰石（nHA）是骨骼的主要无机成分，具有良好的生物活性和骨传导性。将nHA掺入GG基质中，可以显著增强水凝胶的机械强度和成骨潜力。
基于上述背景，河北医科大学的研究团队在《Bioactive Materials》上发表了一项研究，他们成功开发了一种多功能可注射水凝胶系统（Mo-POM@GG/nHA），用于增强骨再生。该研究的核心创新在于将没食子酸（GA）修饰的钼基多金属氧酸盐纳米簇（Mo-POM NCs）负载到GG/nHA复合水凝胶中。理论计算和实验证据表明，GA向PMo12簇的电子转移缩小了其最高占据分子轨道（HOMO）与最低未占分子轨道（LUMO）之间的能隙，从而显著增强了其模拟多种酶（多酶模拟）的活性，使其能有效清除H2O2、O2·?、·OH等多种ROS，重塑免疫微环境。同时，Mo-POM NCs还通过协同破坏细菌膜和生物膜展现出广谱抗菌功能。GG/nHA水凝胶支架不仅为Mo-POM NCs提供了稳定和可控释放的平台，其多孔结构也支持细胞增殖和营养交换，nHA的加入则进一步增强了力学性能并促进了类骨矿化。
关键技术方法
本研究综合利用了纳米材料合成与表征技术（如动态光散射、透射电镜、傅里叶变换红外光谱、X射线光电子能谱等证实Mo-POM NCs的成功制备与理化性质）、水凝胶制备与性能评估（包括溶胀、降解、流变学、机械性能测试）、体外生物学评价（细胞活性/增殖/成骨分化检测、活性氧清除实验、抗菌实验、巨噬细胞极化研究）、体内动物模型（小鼠感染性颅骨缺损模型）以及组学分析（转录组学和蛋白质组学分析分子机制）。
2.1. Mo-POM NCs的表征与理化性质评价
研究人员成功合成了Mo-POM NCs。表征结果显示，其粒径约为2.5 nm，大于未修饰的PMo12（1.1 nm）。傅里叶变换红外光谱（FTIR）和X射线光电子能谱（XPS）分析证实了GA的成功修饰以及Mo6+/Mo5+价态的存在。理论计算（微分电荷密度和态密度分析）揭示了电子从GA转移到PMo12簇，导致HOMO-LUMO能隙从2.95 eV缩小至1.69 eV，增强了其还原能力和多酶模拟活性。实验证明Mo-POM NCs能有效清除H2O2、O2•-、·OH和ABTS自由基，XPS分析进一步证实其ROS清除能力与Mo5+被氧化为Mo6+相关。
2.2. Mo-POM NCs的体外抗菌活性
研究评估了Mo-POM NCs对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌, S. aureus）和革兰氏阴性菌（大肠杆菌, E. coli）的抗菌效果。结果表明，Mo-POM NCs具有浓度依赖性的广谱抗菌活性，对E. coli和S. aureus均表现出显著抑制作用，并能有效抑制生物膜形成。扫描电子显微镜（SEM）观察显示Mo-POM NCs能破坏细菌细胞膜结构。其增强的抗菌能力归因于GA修饰后优化的电荷分布，有利于其与细菌细胞和生物膜物理屏障的相互作用和穿透。
2.3. Mo-POM@GG/nHA水凝胶的表征与理化性质评价
成功制备了Mo-POM@GG/nHA水凝胶。该水凝胶在45°C时为溶胶状态，在37°C生理温度下可迅速转变为凝胶，具有良好的可注射性和形状适应性。扫描电子显微镜（SEM）显示水凝胶具有多孔三维结构，元素分布均匀。傅里叶变换红外光谱（FTIR）证实了各组分成功复合。水凝胶表现出适宜的溶胀率和降解率，以及剪切稀化特性（证明其可注射性）。nHA的加入显著提高了水凝胶的压缩强度，而Mo-POM NCs的添加对其力学性能影响较小。水凝胶能够持续释放Mo-POM NCs。
2.4. Mo-POM@GG/nHA水凝胶的体外抗菌活性
通过涂布法和活/死细菌染色评价了水凝胶的抗菌性能。结果显示，负载了Mo-POM NCs的Mo-POM@GG/nHA水凝胶对E. coli和S. aureus均表现出显著的抗菌效果，尤其对S. aureus的抗菌效率高达99.68% ± 0.21%，表明其具有良好的广谱抗菌活性。
2.5. Mo-POM@GG/nHA水凝胶的体外生物相容性与成骨生物活性
细胞计数试剂盒-8（CCK-8）实验表明Mo-POM NCs在一定浓度下对小鼠骨髓间充质干细胞（mBMSCs）毒性较低，且Mo-POM@GG/nHA水凝胶提取物能显著促进mBMSCs增殖。细胞内活性氧（ROS）清除实验证实该水凝胶能有效降低由H2O2诱导的ROS水平。在成骨诱导实验中，与单纯GG或GG/nHA水凝胶相比，Mo-POM@GG/nHA水凝胶组在培养第7天表现出更高的碱性磷酸酶（ALP）活性和染色强度，在第14天表现出更显著的细胞外基质（ECM）矿化（通过阿尔新红染色ARS评估）。实时荧光定量PCR（RT-PCR）分析显示，Mo-POM@GG/nHA组中成骨相关基因（ALP, BMP-2, Col 1, OPN）的表达水平显著上调，表明其具有强大的成骨诱导能力。
2.6. Mo-POM@GG/nHA水凝胶的体外免疫调节作用
研究探讨了水凝胶对巨噬细胞极化的影响。用脂多糖（LPS）诱导RAW264.7巨噬细胞产生炎症后，与Mo-POM@GG/nHA水凝胶共培养可促使巨噬细胞从促炎的M1表型（表达iNOS）向抗炎的M2表型（表达CD206）转变。免疫荧光染色和RT-qPCR分析证实，Mo-POM@GG/nHA处理显著降低了M1表型标志物（IL-1β, IL-6, iNOS, TNF-α）的mRNA水平，同时上调了M2表型标志物（IL-4, IL-10）的表达。转录组学分析发现Mo-POM@GG/nHA处理影响了与巨噬细胞极化相关的通路，如TNF、核因子κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路。Western Blot分析进一步证实，Mo-POM@GG/nHA水凝胶能抑制IL-1β表达，并有效抑制ERK、JNK和p38的磷酸化，表明其通过下调MAPK信号通路抑制炎症反应。
2.7. 复合水凝胶的体内抗菌活性与骨形成能力
在小鼠感染性颅骨缺损模型中，Mo-POM@GG/nHA水凝胶显著减轻了细菌感染和炎症细胞浸润。在非感染性临界尺寸颅骨缺损模型中，Micro-CT成像和组织学染色（H&E和Masson三色染色）结果显示，植入8周后，Mo-POM@GG/nHA水凝胶组的新骨形成量、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和厚度（Tb.Th）均显著高于其他组。免疫组织化学和免疫荧光染色显示，Mo-POM@GG/nHA水凝胶组骨缺损部位促炎因子IL-1β表达降低，成骨标志物OPN和Col 1表达增强，同时巨噬细胞向M2表型（CD206+）极化增多，M1表型（CD86+）极化减少，表明其在体内有效缓解了炎症并促进了成骨。
2.8. 成骨微环境调控的体内蛋白质组学分析
对术后8周颅骨组织的蛋白质组学分析显示，与对照组相比，Mo-POM@GG/nHA组有202个差异表达蛋白（56个上调，146个下调）。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析表明，水凝胶的治疗作用与粘着斑、血小板活化、神经营养因子信号、细胞外基质（ECM）-受体相互作用以及NOD样受体信号等通路有关。基因本体论（GO）富集分析证实，水凝胶通过调节非经典NF-κB信号、JNK和MAPK级联、MyD88依赖性Toll样受体信号、免疫反应相关的细胞因子产生以及伤口愈合过程，改善了骨缺损部位的免疫微环境，促进了ECM整合、血管化、神经再生和骨组织再生。
2.9. 体外溶血实验
溶血实验表明，Mo-POM@GG/nHA水凝胶的溶血率低于5%，具有良好的血液相容性。
研究结论与意义
本研究成功开发了一种集免疫调节、抗菌、抗氧化和成骨诱导功能于一体的可注射多功能水凝胶（Mo-POM@GG/nHA）。该水凝胶的核心组分Mo-POM NCs通过GA修饰增强了其电子转移能力和多酶模拟活性，能有效清除ROS，缓解氧化应激，并通过破坏细菌膜和生物膜发挥广谱抗菌作用。GG/nHA水凝胶支架不仅为Mo-POM NCs提供了稳定的缓释平台和细胞生长支持结构，其本身的生物活性和nHA的成骨诱导性也协同促进了骨再生。体内外实验证实，该水凝胶能显著促进巨噬细胞向抗炎M2表型极化，抑制促炎反应，并有效增强成骨分化与矿化，最终在感染性和非感染性骨缺损模型中均显著促进了新骨形成。蛋白质组学分析进一步揭示了其通过调控多条信号通路改善骨再生微环境的分子机制。
这项研究的意义在于：首先，它首次将POM纳米簇系统性地应用于骨缺损修复，拓展了POMs在生物医学领域的应用范围。其次，该研究提出了通过单一纳米簇核心调控剂（Mo-POM NCs）实现“一石三鸟”（消除炎症、调节免疫微环境、促进成骨）的创新策略，为设计新一代集成的骨科生物材料提供了新思路和理论实验基础。最后，这种多功能水凝胶在应对伴有感染和炎症的复杂骨缺损方面展现出巨大的临床转化潜力。
