《Current Opinion in Biotechnology》：Recent progress in plant genome engineering: from large insertions to chromosome number changes
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本综述系统梳理了CRISPR/Cas技术引领的植物基因组工程革命，重点聚焦从碱基编辑到染色体组工程的技术飞跃。文章详述了无疤痕大片段插入（如DOTI、PCE）、兆碱基级染色体重排（如DualPE）及染色体数目操控等前沿进展，并探讨了其在作物改良（如性状叠加、生殖隔离、模拟进化）中的应用潜力与当前瓶颈。
引言
全球气候变化和人口增长对粮食安全构成严峻挑战，迫切需要开发可持续的作物育种新策略。传统育种方法存在精度低、周期长等局限，而CRISPR/Cas系统的出现为植物基因组精准修饰带来了革命性工具。最初的研究集中于引入双链断裂（DSB）并通过易错的非同源末端连接（NHEJ）通路产生小片段插入或缺失（indel）。近年来，技术发展已实现从单核苷酸编辑到大规模染色体重排的跨越，为作物改良开辟了全新维度。
近期大片段DNA插入进展
在植物细胞中，DSB主要通过NHEJ通路修复，这给实现精确、无疤痕的大片段序列整合带来挑战。为克服此限制，研究人员开发了多种新策略。
一种策略是优化利用NHEJ通路。例如，将化学修饰的供体DNA（如具有硫代磷酸酯末端的双链寡核苷酸dsODN）与CRISPR/SpCas9结合，可在水稻中实现高达2 kb的靶向插入，效率达25%。进一步优化的定向寡核苷酸靶向插入（DOTI）技术，通过匹配Cas9产生的5‘突出端，在Setaria viridis和水稻中实现了无缝插入，效率高达60.9%。
同源定向修复（HDR）是另一种精确整合途径，但其在植物中的应用受限于低效的同源重组。近期研究通过将5’核酸酶（如疱疹病毒UL12、噬菌体T7）与Cas9或LbCas12a融合，显著提升了HDR效率。在Nicotiana benthamiana中，Cas9-UL12融合使HDR频率提升高达38倍；在拟南芥中提升10倍；在小麦中成功获得了可稳定遗传的超过2 kb的敲入事件。
除了依赖DSB的策略，新兴的DSB-free系统如逆转录酶（RT）、重组酶或转座酶介导的系统，能减少脱靶效应并提高插入效率和精度。Prime editing（PE）是一种RT介导的编辑技术，通过pegRNA将编码的序列变化整合到基因组DNA中。虽然PE在植物细胞中效率有限，但通过工程化改造（如工程化植物Prime编辑器ePPE），其编辑效率已得到提升。更重要的是，PE的高精度特性可用于安装位点特异性重组酶（SSR）的识别序列，从而介导更大片段DNA的靶向整合。例如，PASTE系统将Cas9切口酶与RT及丝氨酸整合酶融合，可在人类细胞中实现高达36 kb的DNA片段整合。在植物中，PrimeRoot系统结合工程化PE与优化的Cre和FLP重组酶，在水稻和玉米中实现了高达11.1 kb的DNA高效整合。近期开发的Programmable Chromosome Engineering（PCE）系统则利用PE插入优化的Cre-Lox重组位点，并通过AI辅助设计的Cre重组酶介导靶向基因组重组，在水稻、玉米和小麦原生质体中实现了高达18.8 kb的精确插入，效率优于PrimeRoot。
CRISPR/Cas相关转座子（CASTs）是另一类强大工具，它将RNA引导的DNA识别与转座酶介导的整合相结合。在细菌中，I-F型CASTs可实现高达10.1 kb的 cargo DNA整合。通过进化改造获得的evoCAST系统在人类细胞中显示出200倍以上的活性提升，可整合超过10 kb的DNA片段。在植物中，受CASTs启发开发的转座酶辅助靶位点整合（TATSI）系统，利用水稻Pong转座子 machinery，在拟南芥和大豆中实现了序列特异性插入。
最近，IS110插入序列家族中的桥RNA（bridge RNA）系统进一步扩展了核酸引导工具库。这些“剪切-粘贴”元件通过一种结构化的非编码桥RNA指导序列特异性重组，其靶点和供体识别环可独立重编程，从而介导DNA的插入、切除或倒位。该系统已在E. coli中得到验证，并在人类细胞中成功诱导了高达0.93 Mb的DNA倒位和缺失，显示出介导复杂基因组重排的巨大潜力。
大规模染色体重排
通过在一条染色体上诱导两个DSB，可以产生精确的缺失、重复或倒位。倒位尤其有助于植物育种，因为它能控制遗传重组，从而破坏或稳定等位基因组合。研究表明，拟南芥中着丝粒周围异染色质序列倒位至常染色质区域，对后代的表观遗传状态和基因表达影响甚微。
CRISPR/Cas方法已在多种植物中实现靶向缺失。在拟南芥中，利用SpCas9成功移除了高达684 kb的同线性区块，包含多达60个基因和112个转座元件，部分植株表现出明显表型和广泛的转录组变化，显示了大规模染色体缺失在基因组精简和等位基因替换中的应用潜力。
除了多重CRISPR策略，双Prime editing（DualPE）系统能够以高精度实现大规模缺失、基因替换和倒位。DualPE使用两个位于靶DNA片段两侧的工程化pegRNA，产生互补的3‘突出端用于缺失或倒位，或产生包含所需序列变化的部分互补突出端用于替换。在小麦中，DualPE介导了高达2 Mb的缺失、258 kb的替换和205 kb的倒位，效率高达51%。在N. benthamiana和番茄中，大片段编辑效率可达72%，使其成为大规模染色体工程和精准作物改良的有效工具。
虽然DualPE适用于精确序列修改，但兆碱基级的倒位通常可通过标准CRISPR/Cas方法更高效地实现。例如，在拟南芥中成功倒位了3.6 Mb的基因组片段，通过交换FLOWERING LOCUS T和HTA3的启动子，改变了基因表达模式。
改变染色体数目
将诱导两个DSB的策略应用于不同染色体，可产生相互易位，从而打破遗传连锁。在拟南芥中，诱导染色体I和II或I和IV之间高达1 Mb的相互易位，植株表现出野生型形态、微小且分散的转录变化、未改变的组蛋白标记谱和跨代稳定的端粒长度，显示了拟南芥对大规模染色体重构的基因组和表型稳健性。
最近，CRISPR/Cas介导的易位被成功用于融合独立染色体，将拟南芥的核型从10条染色体减少到8条。通过在亚着丝粒和亚端粒位点引入断裂，将3号染色体的整条臂融合到1号染色体或重新分配到1号和5号染色体上。尽管核型显著减少，这些植株仍表现出野生型表型和显著的转录组稳定性。然而，与野生型杂交后育性降低，表明定向染色体融合不仅能重塑重组格局，还可通过重新定义连锁群和建立与野生近缘种的生殖隔离来提供新的育种策略。通过臂转移产生的微小染色体在后代中仅被短暂检测到，可能因其缺乏必需基因，表明稳定遗传的最小要求尚未完全明确。
与染色体融合减少染色体数目相对应，通过de novo着丝粒 seeding 可实现染色体数目的增加。在玉米中，通过将LacI融合的CENH3衍生物锚定到染色体臂上的LacO阵列，成功重建了功能性着丝粒。近期的一项研究利用LexA–CENH3融合蛋白将天然CENH3招募到染色体臂上的LexO重复阵列，诱导双着丝粒染色体随机断裂，形成可自我维持、可遗传的新染色体。由此获得的具有22条染色体（而非典型的20条）的品系表现出正常的生长、繁殖和表型。结合CRISPR/Cas工程，这种锚定策略为诱导靶向染色体断裂、实现精确核型重构和de novo染色体构建提供了强大手段。
由此产生的额外染色体为性状叠加提供了可扩展的基因组空间。工程化微小染色体和新染色体凸显了创建适用于高容量应用的合成染色体平台（如植物人工染色体PAC系统）的日益可行性。PAC可作为模块化载体，用于安装大型基因组片段和协调多基因性状或整个生物合成途径，同时将这些组装体作为重组隔离、可遗传的单元进行维持。特别是在基因组冗余的多倍体作物中，合成染色体可提供具有明确拷贝数和可预测遗传性的正交整合位点。
当前实际限制与瓶颈
尽管染色体尺度工程进展迅速，但其实际应用仍受限于转化和DNA递送方面的挑战，这阻碍了大多基因型中大DNA片段的高效导入。大载荷的精确、无标记整合同样受到位点特异性效率低的限制。不过，编辑器性能、供体设计和递送方法的持续改进正在不断扩大可行的插入容量。随着基因型适应性递送平台和靶向整合技术的进步，这些瓶颈有望逐步克服，从而拓宽染色体工程在植物育种中的效用。
结论
CRISPR/Cas的出现将植物基因组工程从单基因操作扩展到染色体尺度的精准干预。大片段插入允许将复杂性状直接引入天然染色体。CRISPR/Cas介导的缺失、倒位和易位为重构染色体和控制基因剂量提供了工具，大规模缺失还可应用于多倍体的染色体精简。这些方法为模拟进化过程、探索染色体长度极限以及产生人工生殖隔离开辟了可能性。随着靶向染色体裂变和融合的最新突破，核型尺度的重编程也已触手可及。这些进展共同指向一个植物育种的新时代，即在染色体水平进行操作，将精准编辑与合成染色体平台相结合，以创造具有韧性的作物和新的遗传多样性。
