《Analytical Chemistry》：Orthogonal Investigation at Single-Particle and Ensemble Levels Uncovers Lipoprotein-Extracellular Vesicle Binding
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本研究通过构建正交分析技术组合（荧光交叉关联光谱FCCS、超分辨显微镜SRM、流式细胞术FC、单分子阵列Simoa），首次在多尺度层面系统揭示人红细胞源细胞外囊泡（REVs）与不同类别脂蛋白（LPs）在缓冲液和血浆环境中的结合特性。研究发现脂蛋白与细胞外囊泡的结合具有类别特异性和环境依赖性，亲和力范围为10 nM至1 μM，且在血浆蛋白存在下高达100%的REVs与高密度脂蛋白（HDL）发生相互作用。该工作为生理条件下细胞外纳米颗粒介观相互作用研究建立了方法学框架，对理解EV-LP复合物的生物学功能及推动囊泡药物递送系统设计具有重要意义。
引言背景
生物流体是纳米结构体系，其中细胞外纳米颗粒（ENPs）如细胞外囊泡（EVs）和脂蛋白（LPs）通过表面相互作用形成动态网络。脂蛋白作为载脂微粒，与EVs的互作可能影响后者的功能特性及体内命运。传统上LPs常被视为EV分离中的污染物，但近期研究表明二者存在物理结合、物质交换及融合等行为，尤其在血浆中LPs数量远超EVs（高达105:1），促使互作发生。本研究选取理化性质均一、易规模化生产的红细胞源EVs（REVs）为模型，结合高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和极低密度脂蛋白（VLDL），在缓冲液（t1）及模拟生理环境（t2，添加去纳米颗粒血浆）中系统解析EV-LP结合机制。
材料与方法
REVs通过钙离子载体A23187诱导红细胞囊泡化并经超速离心纯化，脂蛋白为商品化纯品。采用动态光散射（DLS）表征粒径和ζ电位，蛋白质标记通过Atto 633 NHS酯（REVs）和Atto 488 DPPE（LPs）实现。正交技术包括：
- 1.
超分辨显微镜（dSTORM）：通过DBSCAN算法聚类定位点，分析REV-LP空间共定位；
- 2.
荧光交叉关联光谱（FCCS）：通过交叉关联函数（Gxy(τ)）定量溶液中动态互作比例；
- 3.
流式细胞术（FC）：利用膜感应肽（MSP）功能化磁珠捕获EVs，检测LP结合稳定性；
- 4.
单分子阵列（Simoa）：开发免疫异质夹心法（抗Band 3捕获/抗ApoA1或ApoB100检测），直接检测未标记样本中复合物。
结果与讨论
理化表征：REVs粒径约120 nm，HDL、LDL、VLDL分别为8 nm、15 nm、30 nm；所有颗粒均带负电。Western blot验证REVs表达Band 3、HDL表达ApoA1、LDL/VLDL表达ApoB100，样本无交叉污染。
dSTORM-DBSCAN可视化：在t1/t2条件下均观察到REV-LP共定位（图3），约20%（HDL）至30%（LDL/VLDL）的REVs与LPs结合，血浆添加未显著改变共定位率。
FCCS动态结合分析：
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在血浆环境中，HDL与REVs互作比例最高（ρREVs≈1.0），LDL次之（0.74），VLDL最低（0.38）；
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剂量效应曲线拟合Hill模型显示：HDL结合呈正协同性（n>1），LDL符合Langmuir模型（n≈1），VLDL为负协同（n<1）；
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表观解离常数Kd表明LDL亲和力最高（Kd≈10 nM），HDL与VLDL亲和力低一数量级。
FC稳定性验证：LP结合可抵抗洗涤步骤，且高浓度LP会遮蔽REVs表面位点，抑制MSP结合，提示LP可能形成稳定“冠状结构”。
Simoa免疫检测：新开发 assay 在血浆背景中成功检测到EV-LP复合物，检测限（LOD）低于生理浓度一数量级，为复杂样本分析提供工具。
结论与展望
EV-LP结合是普遍现象，受LP类别、环境因素（如血浆蛋白）及表面位点可及性共同调控。该互作可能影响EVs的膜可及性、细胞摄取及靶向递送效率。本研究建立的多尺度正交分析策略为阐释EVs的“情境依赖性身份”提供了方法论支持，未来可拓展至竞争性结合、功能调控机制及靶向递送系统优化等研究。
