《Science of Traditional Chinese Medicine》：Complete chloroplast genomes and phylogenetic analysis of 7 Murraya species in China
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本研究通过对中国7种九里香属（Murraya）植物进行叶绿体（CP）全基因组测序和比较基因组学分析，揭示了该属植物的系统发育关系、基因组特征及适应性进化。研究确定了可用于物种鉴定的高变区（如ycf1基因），证实了外来九里香（M. exotica）和千里香（M. paniculata）为独立物种，并发现九里香属并非单系群。该研究为芸香科植物分类、DNA标记开发和进化历史研究提供了重要的基因组学数据。
背景与目的
九里香属（Murraya）是芸香科（Rutaceae）灌木和乔木植物，在中国约有9个物种，具有重要的药用和园艺价值。然而，该属的系统发育和分类学存在争议，尤其是外来九里香（Murraya exotica）和千里香（Murraya paniculata）的分类地位。本研究旨在通过对7种九里香属植物的叶绿体（CP）全基因组进行测序、组装和比较分析，为解决其分类、系统发育和物种鉴定问题提供新的见解。
材料与方法
研究收集了32份样品，代表7种九里香属植物，并从GenBank获取了6种芸香科植物的CP基因组数据。利用Illumina NovaSeq 6000平台进行测序，使用GetOrganelle软件进行基因组组装，通过PGA和GeSeq进行注释。利用REPuter和MISA分别分析长重复序列和简单序列重复（SSR）。通过IRscope、mVISTA和MAUVE进行基因组比较和分歧分析。使用EasyCodeML进行阳性选择分析，基于最大似然法（ML）和贝叶斯推断（BI）构建系统发育树，并通过MCMCtree估算分化时间。
结果
基因组特征
九里香属植物的CP基因组长度在158,573至160,817 bp之间，呈现典型的四分体结构，包括大单拷贝区（LSC）、小单拷贝区（SSC）和两个反向重复区（IR）。基因组共编码112个独特基因，包括78个蛋白编码基因、30个tRNA基因和4个rRNA基因。IR区的序列分歧低于单拷贝区，编码区比非编码区更保守。ndhD基因在部分样品中因缺少有效起始密码子而被注释为假基因。
重复序列分析
共鉴定到1233个长重复序列，包括正向、反向、互补和回文重复，其中回文重复最为丰富。检测到7924个SSR，以A/T单核苷酸重复为主。重复序列的数量和分布在物种间存在一定差异。
比较基因组学与IR区边界
IR区的收缩和扩张是影响基因组大小的主要因素。M. kwangsiensis var. macrophylla的IR区发生收缩，导致rps19基因的一个拷贝丢失。比较分析发现多个高变区，如matK、ycf1、ndhI–ndhA、trnH-GUG-psbA和rpl32–trnL，其中ycf1基因被验证可用于区分M. exotica和M. paniculata。
阳性选择分析
在78个共享蛋白编码基因中，检测到10个基因受到阳性选择，包括rbcL、psaJ、ndhD、ndhF、rpl2、rpl20、ycf1、accD、ccsA和rpl32。这些基因主要参与光合作用、蛋白质导入和核糖体组装等过程。
系统发育与分化时间
系统发育分析支持将九里香属划分为两个主要类群：Sect. Murraya（包括M. exotica、M. paniculata和M. alata）和Sect. Bergera（包括M. euchrestifolia、M. kwangsiensis等）。九里香属并非单系群，Sect. Bergera与Clausena亲缘关系更近。分化时间估算显示，Sect. Murraya物种的分化发生在约9.11 Mya（95% HPD: 4.90–13.87 Mya），M. exotica和M. alata的分化时间约为5.85 Mya。
分子标记开发
基于ycf1基因设计特异性引物，成功开发出可区分M. exotica和M. paniculata的分子标记。PCR扩增产物约为450 bp，通过SNP分析可实现准确物种鉴定。
讨论
九里香属CP基因组在结构和基因组成上高度保守，但IR区的收缩扩张及高变区的存在为物种鉴定和系统发育研究提供了重要信息。阳性选择基因可能与其对高光环境的适应性有关。系统发育结果支持将Sect. Murraya和Sect. Bergera提升为属级分类单元，并确认M. exotica和M. paniculata为独立物种。研究开发的ycf1分子标记为药材基原鉴定和资源保护提供了有效工具。
结论
本研究首次报道了5种九里香属植物的CP全基因组，揭示了其基因组特征、重复序列分布和进化动态。研究结果为九里香属的分类修订、物种鉴定和进化历史提供了坚实的基因组学证据，对促进该属植物的药用资源开发和保护具有重要意义。
