《Medical Care》：WGCNA and machine learning identify AURKA, CDK1, and other hub genes associated with immune infiltration as therapeutic targets in GIST: An integrative bioinformatics analysis
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本文通过整合生物信息学方法，结合加权基因共表达网络分析（WGCNA）和机器学习算法（LASSO），从GEO数据集（GSE136755）中筛选出5个与胃肠道间质瘤（GIST）发生发展及免疫浸润密切相关的枢纽基因（AURKA、CDK1、CHEK1、CCNB1、TOP2A）。研究通过蛋白互作网络（PPI）、功能富集分析（GO/KEGG）、受试者工作特征曲线（ROC）及单样本基因集富集分析（ssGSEA）验证基因的诊断价值（AUC 78.1%-89.1%）和免疫调控作用，并经qRT-PCR和Western blot在GIST-T1细胞中实验验证，为GIST的精准诊断和靶向治疗提供了新视角。
摘要
胃肠道间质瘤（GIST）是胃肠道最常见的间叶源性肿瘤，尽管手术和酪氨酸激酶抑制剂（TKI）显著改善了患者预后，但多数患者会在18-24个月内出现耐药，主要与KIT和PDGFRA基因突变相关。本研究通过整合生物信息学分析，旨在发现KIT和PDGFRA之外的新型生物标志物和治疗靶点。研究利用GEO数据库中的GSE136755数据集，通过R语言进行加权基因共表达网络分析（WGCNA），识别共表达模块，并结合GO/KEGG富集分析、蛋白互作网络（PPI）构建、LASSO回归和ROC曲线评估基因的诊断价值。此外，通过单样本基因集富集分析（ssGSEA）探讨枢纽基因与免疫浸润的关联，并在GIST-T1细胞中通过qRT-PCR和Western blot进行实验验证。
1. 引言
GIST年发病率约为1.2/10万，中位发病年龄65岁，其致病机制主要涉及KIT（约80%）和PDGFRA（5-10%）基因突变，导致受体酪氨酸激酶（RTK）持续激活。虽然伊马替尼等TKI药物已成为晚期GIST的一线治疗，但耐药性问题突出，亟需开发新的诊断标志物和治疗策略。本研究采用WGCNA和机器学习方法（如LASSO），结合免疫浸润分析（ssGSEA），系统筛选GIST的关键基因。
2. 材料与方法
基因表达数据来源于GSE136755数据集，经R软件预处理后，选取41例样本（按NIH共识风险分级：高、中、低、极低风险）。通过WGCNA构建共表达网络，识别关键模块（MEblue模块含1323个基因），利用STRING数据库和Cytoscape的CytoHubba插件筛选枢纽基因。功能富集分析（GO/KEGG）揭示基因的潜在功能，LASSO回归进一步筛选核心基因，ROC曲线评估诊断效能（AUC>0.75）。ssGSEA分析28种免疫细胞浸润与基因表达的关系，并在GIST-T1细胞中通过qRT-PCR和Western blot验证基因表达。
3. 结果
3.1. 数据预处理
从GSE136755数据集的65例样本中筛选41例，涵盖不同风险等级，用于后续分析。
3.2. WGCNA与关键模块识别
WGCNA分析识别出5个基因模块，其中MEblue模块与GIST表型相关性最强（cor=0.73, P<0.01），包含1323个基因。
3.3. PPI网络与枢纽基因筛选
PPI网络分析筛选出前10个枢纽基因：CDK1、CCNB1、CCNA2、TOP2A、AURKA、AURKB、CDCA8、CHEK1、BUB1和RAD51。
3.4. 功能富集分析
KEGG富集分析显示基因显著富集于PI3K-Akt信号通路、钙信号通路等；GO分析表明基因参与细胞粘附、染色体分离、血管生成等生物学过程。
3.5. 核心基因验证
LASSO回归确定5个核心基因：AURKA、CDK1、CHEK1、CCNB1和TOP2A。ROC曲线显示其诊断效能优异（AUC：AURKA 89.1%，CDK1 81.2%，CHEK1 84.4%，CCNB1 85.9%，TOP2A 78.1%）。箱线图表明这些基因在GIST样本中表达显著上调。
3.6. 免疫浸润分析
ssGSEA揭示核心基因与免疫细胞浸润密切相关，如AURKA与单核细胞、活化CD4+T细胞正相关，CDK1与活化CD4+T细胞、记忆B细胞正相关，提示这些基因可能通过调控肿瘤免疫微环境影响GIST进展。
3.7. 实验验证
qRT-PCR和Western blot证实AURKA、CDK1、CHEK1、CCNB1和TOP2A在GIST-T1细胞中高表达，验证了生物信息学分析结果的可靠性。
4. 讨论
本研究首次通过整合WGCNA、机器学习和免疫浸润分析，系统筛选出5个GIST关键基因（AURKA、CDK1、CHEK1、CCNB1、TOP2A），这些基因均参与细胞周期调控和DNA损伤应答（DDR）通路，其过表达可能导致基因组不稳定性及TKI耐药。功能富集分析提示PI3K-Akt通路等关键致癌机制参与GIST发生。免疫浸润分析进一步揭示基因与肿瘤微环境的相互作用，为免疫治疗提供新靶点。实验验证强化了结果的生物学意义，但研究仍存在局限性，如样本来源单一、缺乏健康对照，未来需在多中心队列和不同分子亚型（如SDH缺陷型GIST）中进一步验证。
5. 结论
AURKA、CDK1、CHEK1、CCNB1和TOP2A可作为GIST潜在的诊断标志物和治疗靶点，其与免疫浸润的关联为开发联合治疗策略（如DDR抑制剂+TKI）提供了理论依据。未来研究应聚焦于这些基因的临床转化价值，推动GIST的精准医疗发展。
