《Frontiers in Immunology》：C-X-C motif chemokine ligand 13 suppresses osteoclast differentiation via interference with RANKL–RANK interaction
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本研究揭示了C-X-C基序趋化因子配体13（CXCL13）在骨代谢中的新功能。研究发现，CXCL13能够以不依赖于其经典受体CXCR5的方式，直接与破骨细胞分化关键受体RANK结合，竞争性抑制RANKL（核因子κB受体活化因子配体）与RANK的相互作用，进而下调MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）和NF-κB（核因子κB）信号通路活化，最终抑制破骨细胞生成并诱导成熟破骨细胞凋亡。这为骨质疏松、关节炎等骨丢失疾病的治疗提供了新的潜在靶点。
引言
骨稳态依赖于骨形成成骨细胞和骨吸收破骨细胞之间的动态平衡。这一平衡的破坏可导致病理性骨丢失，例如在骨质疏松、关节炎和溶骨性骨转移中。破骨细胞生成是破骨细胞从单核/巨噬细胞前体分化的生物学过程，主要由RANKL驱动，RANKL与其受体RANK结合，启动细胞内信号级联反应。特别是，RANKL-RANK相互作用通过MAPK通路和IKK复合物促进NF-κB活化，导致破骨细胞分化和功能所必需的基因转录。当前针对骨丢失疾病的治疗通常侧重于通过靶向RANK/RANKL轴来抑制破骨细胞分化和功能。C-X-C基序趋化因子配体13（CXCL13）是CXC趋化因子家族的成员，最初因其在B细胞迁移中的功能而被识别为B细胞吸引趋化因子1。CXCL13与其受体CXCR5结合，从而促进免疫细胞募集和调节适应性免疫反应。然而，CXCL13在破骨细胞生物学中的作用尚未明确。
材料与方法
本研究使用RAW264.7细胞系，用RANKL刺激诱导破骨细胞生成。通过TRAP（抗酒石酸酸性磷酸酶）和F-肌动蛋白（F-actin）环染色以及定量实时PCR（qPCR）评估破骨细胞形成。通过GEO生物信息学分析揭示RANKL诱导的破骨细胞生成过程中的基因表达变化。通过切割的caspase-3免疫荧光染色分析成熟破骨细胞凋亡。通过蛋白质印迹（Western blot）和NF-κB荧光素酶报告基因检测检查MAPK和NF-κB信号通路的活化。通过分子对接和免疫共沉淀（Co-IP）评估CXCL13与RANK之间的相互作用。
结果
CXCL13抑制RANKL诱导的破骨细胞形成并下调破骨细胞标志基因表达
为评估CXCL13在破骨细胞生成中的作用，研究人员使用了基于RANKL处理的RAW264.7细胞培养5天的标准体外破骨细胞分化模型。数据显示，CXCL13以浓度依赖的方式抑制RANKL诱导的破骨细胞形成，表现为TRAP阳性多核细胞数量的显著减少。对GEO公共数据集的分析显示，在数据集GSE225974中，与人外周血单核细胞（PBMC）相比，人破骨样细胞中Acp5、Ctsk、Mmp9和Nfatc1的表达水平显著升高。类似地，在数据集GSE191187中，这些破骨细胞相关基因在RANKL处理的小鼠破骨细胞前体（OCP）中相对于未处理的对照组显著升高。qPCR分析证实，RANKL显著促进了RAW264.7细胞中Acp5、Ctsk、Mmp9和Nfatc1的表达，而CXCL13处理减弱了这种诱导作用。
CXCL13促进成熟破骨细胞凋亡
在破骨细胞生成过程中，成熟破骨细胞形成其特征性的肌动蛋白环结构。为直接检查CXCL13在成熟破骨细胞中的作用，RAW264.7细胞用RANKL处理以促进成熟破骨细胞形成，随后用CXCL13处理1天。TRAP染色表明，CXCL13减少了成熟破骨细胞的数量和面积。Phalloidin染色用于可视化F-肌动蛋白环的形成。在仅用RANKL的组中，观察到组织良好、完整的肌动蛋白环。相比之下，CXCL13处理诱导了足体带结构的显著、剂量依赖性破坏。成熟破骨细胞用递增浓度的CXCL13处理后，通过免疫荧光分析显示，与仅RANKL组相比，凋亡关键标志物切割的caspase-3显著上调。
CXCL13抑制RANKL诱导的MAPK和NF-κB信号通路
RANKL刺激触发MAPK（ERK、JNK和p38）和NF-κB信号通路的激活。为研究CXCL13是否调节这些通路，研究人员检查了RANKL刺激后MAPKs的磷酸化状态。结果表明，CXCL13抑制了ERK、JNK和p38的磷酸化。CXCL13处理还降低了IKKα/β的磷酸化，并有效阻止了IκBα的降解。此外，NF-κB p65亚基的磷酸化被CXCL13处理显著降低。免疫荧光分析表明，RANKL刺激显著促进了p65在RAW264.7细胞中的核转位。相比之下，CXCL13处理显著减弱了RANKL诱导的p65核定位。此外，RANKL刺激显著增加了NF-κB荧光素酶活性，而CXCL13处理显著降低了这种活性。
CXCL13与RANKL竞争性结合RANK，从而抑制破骨细胞分化
CXCR5是CXCL13的经典受体。为确定CXCL13对破骨细胞分化的影响是否由CXCR5介导，研究人员在RANKL诱导的破骨细胞生成过程中使用siRNA沉默Cxcr5表达。TRAP染色显示，CXCR5敲低未能逆转CXCL13对破骨细胞分化的抑制作用。蛋白质印迹分析表明，CXCR5沉默也不影响CXCL13抑制MAPKs和NF-κB信号通路组分磷酸化的能力。这些结果表明CXCL13对破骨细胞生成的抑制作用不依赖于CXCR5。基于此，研究人员假设CXCL13可能直接与RANK受体相互作用。为探索这种可能性，使用Discovery Studio软件进行了分子对接研究。在 macromolecular docking 分析中，使用从蛋白质数据库（PDB）获得的mRANK和mCXCL13结构进行了虚拟筛选。在ZDOCK平台上进行对接后，基于ZDOCK/ZRANK分数和姿势聚类进行了初步筛选，以缩小潜在结合姿势的范围，用于后续的分子动力学（MD）模拟和最终构象的确定。在CXCL13和RANK之间产生的2000个预测结合姿势中，姿势3、6和10显示出最强的结合亲和力。尽管姿势3表现出比其他姿势更有利的能量分数，但研究人员选择姿势6和10进行MD模拟步骤，因为它们的聚类特性和整体可靠性。预测CXCL13以姿势6和姿势10结合到RANK的胞外域，其结合能量在50纳秒的分子动力学模拟过程中保持稳定。为评估这些复合物的稳定性，进行了分子动力学模拟。均方根偏差（RMSD）分析显示，与姿势6相比，姿势10随时间推移保持了更大的结构稳定性。均方根涨落（RMSF）分析进一步表明，在姿势10复合物中，链B（而非链A）界面处的原子流动性降低，支持其增强的构象稳定性。RANKL结合后，TNF受体相关因子6（TRAF6）被募集到RANK的胞质域，启动关键通路（如MAPKs和NF-κB）的激活，从而驱动破骨细胞生成基因的转录。免疫共沉淀（Co-IP）实验表明，RANKL显著促进了RANK和TRAF6之间的相互作用，而与CXCL13共处理则 substantially 减少了TRAF6向RANK的募集。
讨论
趋化因子被认为是破骨细胞形成和活性的重要调节因子。本研究发现CXCL13抑制RANKL诱导的破骨细胞形成。CXCL13还抑制了RANKL诱导的MAPK和NF-κB信号通路。有趣的是，CXCL13的抑制作用并非通过其经典受体CXCR5介导，而是通过与RANK的直接相互作用。破骨细胞生成和骨吸收受到破骨细胞特异性基因表达的严格控制。本研究数据显示，CXCL13显著下调了RAW264.7细胞中这些RANKL诱导基因的表达。CXCL13不仅抑制破骨细胞生成，还诱导成熟破骨细胞凋亡。MAPK和NF-κB信号通路是RANKL-RANK相互作用激活的明确级联通路，对破骨细胞分化、激活和存活至关重要。本研究证明CXCL13显著抑制了RAW264.7细胞中RANKL诱导的ERK、JNK和p38的磷酸化。我们发现CXCL13抑制了RANKL诱导的IKKα/β、IκBα和p65的磷酸化，以及p65核转位和NF-κB荧光素酶活性。分子对接分析结合Co-IP实验表明，CXCL13干扰了RANKL和RANK之间的相互作用，从而减弱了参与破骨细胞生成的下游信号通路。Co-IP实验证实CXCL13显著减少了TRAF6向RANK的募集。这些发现支持了CXCL13可能直接与RANK相互作用，潜在地与RANKL竞争受体结合的假设。
总之，本研究揭示了CXCL13在骨代谢中的新作用，表明其通过一种不依赖于经典趋化因子受体的新机制，直接靶向RANKL-RANK信号轴，有效抑制破骨细胞生成并促进破骨细胞凋亡，为治疗骨丢失疾病提供了新的思路和潜在靶点。
