《Frontiers in Oncology》：Modeling and validation of serum miR-18a and miR-122 levels as predictors of recurrence after laparoscopic radical cystectomy procedure for bladder cancer based on nomogram model
1 引言
膀胱癌（Bladder Cancer, BC）是泌尿系统中常见且极具危险性的恶性肿瘤，起源于膀胱黏膜上皮细胞的恶性转化与异常增殖。腹腔镜根治性膀胱切除术（Laparoscopic Radical Cystectomy）是BC的重要治疗手段之一，具有创伤相对较小、术后恢复较快等优点。然而，即使经过手术切除，BC仍存在一定的复发风险。准确预测BC术后复发对于优化治疗方案、改善患者预后至关重要。
随着癌症研究的深入，生物标志物（Biomarker）受到广泛关注。血清微小核糖核酸（microRNA, miRNA）因其稳定性和易于检测的特点，吸引了研究者的注意。其中，血清miR-18a被发现广泛参与细胞增殖、分化、凋亡等过程，研究表明其在多种肿瘤的发生发展中扮演重要角色，与肿瘤细胞的侵袭和转移潜力密切相关，有望成为肿瘤早期诊断和预后判断的关键指标。而miR-122长期以来在肝脏相关疾病领域被研究，近期证据表明，miR-122在泌尿系统肿瘤，尤其是BC中亦具有独特的调控功能，能够影响BC的生物学行为，或可作为反映BC疾病进展的潜在标志物。
鉴于此，本研究旨在综合考虑血清miR-18a和miR-122的水平，探讨BC腹腔镜根治性膀胱切除术后复发的影响因素，并基于这些因素构建和验证列线图（Nomogram）预测模型，以期为临床决策提供有力参考，辅助BC患者的精准诊疗。
2 数据与方法
2.1 研究对象
经医院伦理委员会批准后，回顾性纳入2021年1月至2022年10月期间接受腹腔镜根治性膀胱切除术的280例BC患者。采用完全随机化方法将患者按7:3的比例随机分为训练集和验证集。训练集用于识别风险因素并构建列线图预测模型，验证集用于对模型的区分度、校准度和临床实用性进行初步的独立评估。所有参与者均知情同意。
2.2 纳入排除标准
2.2.1 纳入标准
(1) 经组织病理学检查确诊为BC，涵盖尿路上皮癌、鳞状细胞癌、腺癌等病理类型。(2) 年龄18岁及以上成年患者，能配合随访检查、治疗及随访。(3) 采用腹腔镜根治性膀胱切除术。(4) 根据美国东部肿瘤协作组（Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG）体力状态评分选择0-2分者，具备基本自理能力，能耐受手术及定期随访。
2.2.2 排除标准
(1) 患有其他严重恶性肿瘤且未有效控制者。(2) 合并严重心、肝、肾功能不全者。(3) 患有精神疾病或认知障碍无法配合问卷、定期采血检测及及时随访者。(4) 术前已接受过其他BC抗癌治疗（如放化疗）者。
2.3 腹腔镜根治性膀胱切除术治疗
手术过程涉及多个步骤。患者全麻后，取仰卧位，消毒铺巾。于脐部作切口，插入气腹针，注入二氧化碳气体建立气腹，然后置入腹腔镜。此外，在腹部适当部位建立两到三个辅助操作通道。术中使用超声刀分离膀胱周围韧带和组织。对于男性患者需处理前列腺，女性患者则涉及前阴道壁相关操作。同时游离并切断输尿管以作标记。所有患者均常规行标准盆腔淋巴结清扫术（pelvic Lymph Node Dissection, pLND），包括清除闭孔、髂内和髂外区域的淋巴结组织。随后完全切除膀胱。标本打包后经扩大的切口取出。膀胱完全切除后，常规对远端输尿管切缘进行术中冰冻切片分析以确保手术切缘阴性。若计划行原位新膀胱，则同时对近端尿道切缘进行冰冻切片分析。若发现切缘阳性，则额外切除组织直至确认阴性。术后对所有切缘进行最终病理学检查。最后，根据患者情况选择回肠膀胱术（Bricker procedure）或原位新膀胱术进行尿流改道。术后根据机构方案进行恢复管理。
2.4 术前调查
2.4.1 问卷调查
术前通过问卷调查患者的基本信息（年龄、性别、体重指数（Body Mass Index, BMI）、吸烟史、饮酒史、职业暴露史、BC家族史）和合并症（高血压、糖尿病）。
2.4.2 膀胱镜检查
通过膀胱镜活检在术前确认膀胱癌的诊断和初步病理类型。最终的病理分期来自术后根治性膀胱切除术标本的分析。
2.4.3 CT检查
采用国际抗癌联盟（Union for International Cancer Control, UICC）的TNM分期系统，通过CT检查肿瘤大小、位置、是否侵犯周围组织、是否存在淋巴结转移和远处转移，辅助确定T、N、M分期。采用世界卫生组织（World Health Organization, WHO）分级系统，观察肿瘤细胞分化程度、核异型性和核分裂象，判断肿瘤分级。
2.4.4 血清检查
采集患者空腹状态下外周静脉血约3-5 mL。使用miRNeasy Serum/Plasma Kit（Qiagen）提取miR-18a和miR-122。以U6小核RNA（U6 snRNA）为内参基因。使用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems）进行逆转录反应。使用特异性TaqMan探针和引物（Applied Biosystems）进行qPCR扩增。通过构建合成miR-18a和miR-122标准物质（Thermo Fisher Scientific）的标准曲线，实现血清miR-18a和miR-122水平的绝对定量（单位为pg/mL）。
2.5 术后调查
2.5.1 血清检测
术后1-3天内（早期术后阶段，正式随访前）采集患者外周静脉血3-5 mL。使用Cobas e601自动化学发光免疫分析仪（Roche Diagnostics）及相应的Elecsys CEA检测试剂盒和Elecsys CA19-9检测试剂盒（Roche Diagnostics）检测血清癌胚抗原（Carcinoembryonic Antigen, CEA）和糖类抗原19-9（Carbohydrate Antigen 19-9, CA19-9）水平。
2.5.2 术后观察
医护人员密切观察并记录术后首次排尿时间、导尿管留置和拔除时间、抗生素开始使用和停用日期以计算使用时长。
2.6 随访调查
2.6.1 随访时间与内容
随访期为28个月。通过临床访视和电话访谈定期随访患者。主要使用影像学检查（如腹部和盆腔计算机断层扫描（Computed Tomography, CT）或磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging, MRI））监测复发。从医院病历中收集辅助治疗（化疗或放疗）信息。辅助化疗方案主要包括吉西他滨联合顺铂（GC方案）和甲氨蝶呤+长春碱+多柔比星+顺铂（MVAC方案）。
2.6.2 复发判定方法
随访期间定期进行盆腔和腹部CT或MRI等影像学检查。根据影像学结果评估局部复发或远处转移的发生。若发现可疑病变，则进行活检。病理结果证实存在与膀胱癌一致的恶性肿瘤组织则判定为复发。
2.7 统计分析
使用SPSS 26.0和R 4.2.3进行统计分析。计数资料采用频数和百分比描述，采用χ2检验。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，采用独立样本t检验。在训练集中，对所有变量进行单因素分析，初步筛选出可能与结局相关的变量。将单因素分析筛选出的变量纳入多因素Logistic回归分析，进一步确定独立危险因素（P<0.05），并计算其比值比（Odds Ratio, OR）和95%置信区间（Confidence Interval, CI）。绘制模型的受试者工作特征（Receiver Operating Characteristic, ROC）曲线，确定模型的敏感性、特异性、约登指数和最佳截断值。通过曲线下面积（Area Under the Curve, AUC）评估模型区分度。绘制校准曲线并采用Hosmer-Lemeshow检验进行评估。绘制决策曲线分析（Decision Curve Analysis, DCA）以检验模型的实际应用效能。P值<0.05认为有统计学意义。
3 结果
3.1 训练集与验证集基线特征比较
共纳入280例接受腹腔镜根治性膀胱切除术的BC患者。训练集196例患者中复发46例（23.47%），验证集84例患者中复发21例（25.00%）。训练集与验证集在复发率、血清miR-18a、miR-122水平及其他相关参数上均无显著差异（P>0.05）。
为评估辅助化疗对术后生物标志物水平的潜在影响，比较了接受与未接受辅助化疗患者的血清CEA和CA19-9水平。结果显示，辅助化疗组术后血清CEA水平为3.52±1.31 ng/mL，非辅助化疗组为3.47±1.28 ng/mL（P=0.321）。辅助化疗组术后血清CA19-9水平为24.12±7.85 U/mL，非辅助化疗组为23.76±7.43 U/mL（P=0.285）。两组术后CEA和CA19-9水平无显著差异，提示辅助化疗对当前队列中这些生物标志物的混杂影响有限。
3.2 训练集中复发组与非复发组单因素分析
训练集中单因素分析显示，复发组与非复发组在术前血清miR-18a水平、术前血清miR-122水平、术后血清CEA水平、术后血清CA19-9水平、术后抗生素使用时间上差异均有统计学意义（均P<0.05）。
3.3 BC腹腔镜根治性膀胱切除术后复发影响因素的多因素Logistic回归分析
以是否复发为因变量（0=未复发，1=复发），将单因素分析中P<0.05的因素作为协变量。进一步多因素Logistic回归分析显示，术前血清miR-18a水平、术前血清miR-122水平、术后血清CEA水平、术后血清CA19-9水平、术后抗生素使用时间与BC腹腔镜根治性膀胱切除术后复发显著相关（均P<0.05）。
3.4 BC术后复发列线图预测模型的构建
基于多因素Logistic回归分析确定的独立危险因素，构建了BC术后复发列线图预测模型。模型中对每个独立危险因素进行评分，计算预测BC术后复发的总评分，并体现在预测BC术后复发概率上。总评分越高，BC术后复发风险越高。
3.5 BC术后复发列线图预测模型的评价与验证
在训练集和验证集中，列线图模型的C-index分别为0.796和0.762，校准曲线显示预测值与实际值的平均绝对误差分别为0.120和0.121，Hosmer-Lemeshow检验结果分别为χ2=10.64, P=0.223和χ2=12.72, P=0.122。训练集和验证集中列线图模型预测BC术后复发的ROC曲线AUC分别为0.796（95% CI: 0.688-0.904）和0.762（95% CI: 0.578-0.946），敏感性和特异性分别为0.606, 0.944和0.615, 0.953。
3.6 BC术后复发列线图预测模型的决策曲线分析
决策曲线显示，当阈值概率大约在0.05至0.95之间时，本研究构建的列线图模型在预测BC术后复发决策方面具有更多的临床获益。
4 讨论
腹腔镜根治性膀胱切除术是BC治疗领域的重要手术方式。其原理基于腹腔镜的微创优势，通过小切口置入腹腔镜器械，借助腹腔镜高清成像系统，医生可精准、直观地操作膀胱及周围组织，实现肿瘤病灶的完整切除。在膀胱切除过程中，能最大程度减少对周围正常组织的损伤，降低术中出血风险，同时保留部分机体功能。在应用现状方面，该技术目前已在各大医疗机构广泛应用，尤其适用于早期BC患者。与传统开放手术相比，它缩短了患者术后住院时间，减轻了术后疼痛，有利于患者快速康复，提高了患者生活质量。然而，对于部分局部晚期或复杂病例，手术难度和风险仍然较高，技术要求更为苛刻。
为深入探讨腹腔镜根治性膀胱切除术后复发的影响因素，本研究通过单因素及多因素分析纳入了多项关键指标。首先是血清微小核糖核酸（miRNA）中的miR-18a和miR-122。在分子机制层面，血清miR-18a可调控与肿瘤进展密切相关的多个信号通路，如PI3K-Akt和MAPK通路，这些通路的异常激活或抑制与肿瘤细胞的侵袭和转移潜力密切相关。MiR-122可靶向结合BC相关基因，通过影响基因的转录和翻译过程，调控BC细胞的增殖速率、迁移能力等生物学行为。
CEA作为常见的肿瘤标志物，其血清浓度在多种肿瘤的发展过程中会发生改变。BC术后血清CEA水平升高可能反映了体内肿瘤细胞负荷增加，提示肿瘤细胞存在残留或复发迹象。其原理是肿瘤细胞将CEA分泌到血液循环中，当肿瘤处于活跃生长、转移和复发阶段时，分泌量会显著增加。CA19-9广泛应用于消化系统肿瘤的监测，其在尿路上皮癌中的意义也在探索中。BC术后，肿瘤细胞与周围基质细胞的相互作用可能导致CA19-9释放增加，表明肿瘤增殖活跃和肿瘤微环境发生变化。
术后抗生素使用时长也被视为常规因素。术后合理使用抗生素旨在预防感染，但使用时间过长或过短均可能产生不良影响。使用时间过长一方面可能诱发耐药菌滋生，增加患者后续感染风险，导致机体免疫功能障碍，间接为肿瘤复发创造条件；另一方面，某些抗生素可能干扰机体正常细胞代谢，影响抗肿瘤免疫机制。
基于上述关键因素，构建了预测BC术后复发的列线图模型。该模型整合了术前血清miR-18a和miR-122水平、术后血清CEA和CA19-9水平以及术后抗生素使用时间等独立危险因素。通过内部验证，无论在训练集还是验证集，该模型均显示出良好的预测性能。模型区分度（C-index指标）、预测值与真实值之间的拟合优度（校准曲线）、ROC曲线显示的敏感性和特异性等多种评价指标，均有力证明了该模型的准确性和可靠性，凸显了其在临床实践中的潜在应用价值。
然而，本研究也存在一些局限性。首先，研究仅纳入了未接受新辅助化疗（Neoadjuvant Chemotherapy, NAC）的患者，这限制了研究结果在更广泛的肌层浸润性膀胱癌患者中的普适性。因此，现阶段该模型可能最适用于因禁忌症未接受NAC的肌层浸润性膀胱癌患者或高危非肌层浸润性膀胱癌患者，其普适性需要在更广泛的人群中进一步验证。其次，研究仅纳入了接受回肠膀胱术或原位新膀胱术重建的患者，排除了接受输尿管皮肤造口术的患者，这限制了列线图的普适性，其对于接受输尿管皮肤造口术这一特定亚组患者的适用性尚不明确，需要未来验证。第三，CA19-9和CEA的测量基于单一的术后时间点，这排除了对其动态变化 kinetics 的分析，而动态变化可能比静态值提供更优的预测信息。重要的是，我们承认这些生物标志物的水平可能受到辅助化疗的影响。需要设计具有方案定义的系列采血的前瞻性研究，以确定这些生物标志物的最佳术后轨迹，并在严格考虑化疗影响的环境中验证其作用。关于样本量，尽管纳入280例患者为模型构建提供了初步数据基础，但在复杂多变的肿瘤研究领域，尤其是考虑到BC的高度异质性，相对有限的样本量无法覆盖所有可能情况，扩大样本量有望进一步提高模型的稳定性和准确性。目前，本研究侧重于血清学指标和少数常规临床指标，未能全面纳入肿瘤微环境、患者遗传背景等深层次因素。此外，由于当前研究资源和条件限制，未进行外部验证。由于队列中变异组织学病例数量有限，未对纯尿路上皮癌和组织学变异型（如鳞状细胞癌、腺癌）的复发率进行亚组分析。因此，我们的列线图在不同组织学亚型中的预测性能仍有待在更大规模、专门设计的研究中进一步验证。最后，我们的模型依赖于术前变量，包括基于活检的病理学，这可能无法反映最终的术后分期（例如，疾病分期升级）。这种术前模型固有的局限性在解释我们的预测时应予以考虑。此外，研究设计侧重于基线样本，阻止了对术后miRNA动态变化的评估。需要具有纵向采样的前瞻性研究来评估miRNA在监测复发方面的潜力。
总之，基于术后单次测量的血清miR-18a和miR-122水平的列线图模型在本研究背景下显示出预测BC患者复发的潜在预后价值。然而，鉴于测量的静态性质以及辅助化疗的潜在混杂影响，其临床效用必须谨慎解读。需要纳入系列生物标志物测量和详细治疗数据的未来前瞻性研究来验证和完善该模型，以实现动态风险评估。
