《Frontiers in Microbiology》：Molecular investigation on hazelnut-associated Fusarium isolates belonging to the Fusarium citricola species complex
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本综述通过对意大利和波兰榛子相关镰刀菌分离株的多基因（tef-1和rpb2）系统发育分析，结合ABGD、mPTP和GMYC三种物种界定算法，证实这些菌株均属于Fusarium citricola物种复合群（FCCSC），并指出当前对F. aconidiale、F. celtidicola和F. juglandicola三个物种的划分缺乏充分的分子证据。研究强调了物种界定方法在厘清镰刀菌（Fusarium）近缘种复合群（如FTSC和FCCSC）分类关系中的重要性，为真菌毒素污染风险评估提供了新的分类学框架。
1 引言
镰刀菌属（Fusarium）是一类广泛存在于自然界的丝状子囊菌，可定殖于土壤、植物残体等多种基质。许多镰刀菌是重要的植物病原菌，在全球范围内对多种作物造成毁灭性病害。该属包含超过400个系统发育学上 distinct 的物种，归属于30多个物种复合群及若干单型谱系。尽管形态特征提供有价值的诊断信息，但其在镰刀菌物种水平鉴定中的可靠性受到高表型可塑性和种间性状重叠的限制。这种形态上的趋同（或共祖征）使得远缘分类群共享相似特征，历来使镰刀菌分类学和物种鉴定复杂化。因此，整合分子方法，特别是DNA条形码和多基因座测序，已成为精确物种划界的关键。
榛子（Corylus avellana）的经济影响日益增加，2023年全球带壳榛子产量估计为115万吨。产品储存和销售的一个主要关切是真菌引起的坚果污染，其产生多种真菌毒素，受到监管机构越来越多的关注。在这方面，镰刀菌的作用值得更深入的评估，因为它们以产生单端孢霉烯族毒素和恩镰孢菌素等真菌毒素而闻名，并且与该作物相关的报道数量不断增加。
从榛子中分离的镰刀菌是传统形态分类方案不足以进行准确物种鉴定并经常导致错误分类的有力例证。早期对意大利维泰博地区榛子坚果灰斑病（NGN）的研究将病原鉴定为Fusarium lateritium。然而，最近的基因组证据对此提出质疑，指出这些分离株与Fusarium tricinctum物种复合群（FTSC）亲缘关系更近。随着与FTSC相关的新谱系——Fusarium citricola物种复合群（FCCSC）的界定，从波兰榛子中获得的两个内生菌分离株被鉴定为该复合群的成员。尽管对其中一个分离株的全基因组测序后来证实了这一推论，但当时可用的参考菌株数量有限，无法最终将其归入Fusarium celtidicola或Fusarium juglandicola。关于这些物种间分离的类似不确定性也出现在最近一项基于知名菌种保藏中心菌株的系统发育研究中，这些菌株曾被归类为F. lateritium，但发现其属于FTSC或FCCSC。在此背景下，来自意大利和波兰的更广泛分离株使得我们能够进行更全面的系统发育重建，并辅以物种界定分析。
2 材料与方法
2.1 Fusarium isolates
2023年5月至6月，在意大利维泰博地区的三个榛子园进行了田间调查，以探查早期NGN症状。从‘Nocchione’和‘Tonda Romana’品种上采集的25个有症状榛子样品被密封在无菌塑料袋中，送至维泰博大学植物病理学实验室。简要来说，榛子内核部分用3%次氯酸钠表面消毒3分钟，用无菌蒸馏水冲洗两次，并在层流下干燥。从健康和病组织切取1厘米片段，无菌放置在PDA平板上，于25 ± 1°C培养5-7天。通过将新生菌落连续转接至新鲜PDA平板获得纯真菌培养物，用于形态学和分子分析。除先前研究可用的分离株外，从波兰克拉科夫地区的榛子和小叶椴（Tilia cordata）次生枝中又采集了四个符合FCCSC的内生分离株。
2.2 DNA extraction and PCR amplification for molecular characterization
使用植物基因组DNA提取试剂盒从PDB培养的纯菌丝体中提取基因组DNA。分子鉴定通过扩增翻译延伸因子1-α（tef-1）和RNA聚合酶II第二大亚基（rpb2）基因区域进行。每个PCR反应使用5 ng gDNA作为模板，最终体积25 μL。tef-1和rpb2的扩增程序分别包括初始变性、多个循环的变性、退火、延伸以及最终延伸步骤。扩增产物通过1.2%琼脂糖凝胶电泳分析，并送测序。
2.3 Phylogenetic and species delimitation analyses
对所有收集的Fusarium分离株以及GenBank中可用的属于FCCSC和FTSC的60个菌株进行了详细的系统发育分析；以F. lateritium NRRL 13622作为外群。使用UGENE编辑原始序列，使用MUSCLE进行比对。使用RAxML-HPC基于GTRGAMMAI替代模型和1000次bootstrap重复构建最大似然（ML）系统发育树。
物种界定分析采用基于距离的自动条形码间隙发现（ABGD）、广义混合Yule- coalescent（GMYC）模型和具有多速率Poisson树过程（mPTP）方法，使用RAxML输出树作为输入。ABGD分析参数设置为测试变异性（P）在0.001（Pmin）和0.1（Pmax）之间，最小间隙宽度0.1，使用Kimura 2-参数模型和50个筛选步骤。mPTP方法使用MCM或ML算法运行5000万代，每1000代采样一次。GMYC分析在BEAST2上构建超度量树，设置GTR + G + I替代模型的gamma位点模型、Yule先验和松弛分子钟，MCMC运行5000万代，每1000代采样一次。使用Tracer检查收敛性和有效样本大小（ESS > 200），并使用Treeannotator获得最大可信度枝树，丢弃前10%的树作为burn-in期。然后将生成的树导入R环境，使用splits包进行单阈值GMYC分析。
3 结果
3.1 Morphological features
从维泰博地区NGN症状植株采集的榛子样品显示果皮表面存在橙色至浅棕色分生孢子座，表明有活跃的真菌生长；这些子实体结构包含大量透明、多隔、新月形的大分生孢子。从内核组织分离 consistently 获得Fusarium；共回收17个分离株并储存于纯培养物中用于后续评估。在克拉科夫地区又回收了四个具有相似形态特征的Fusarium分离株。在PDA上，致病性和内生性分离株的形态特征与先前报道的波兰分离株描述相当且一致。在SNA上，从单瓶梗型产孢细胞产生丰富的大分生孢子。这些分生孢子透明、多细胞，通常具3-5个隔膜，略弯曲并向两端渐细。在整个14天的培养期内，未检测到培养基着色，且不产生小分生孢子。意大利分离株中未发现厚垣孢子，而在所有检查的波兰分离株中 consistently 观察到厚垣孢子。
3.2 Phylogenetic and species delimitation analyses
基于所选DNA标记的系统发育分析证实所有分析的菌株均属于Fusarium citricola物种复合群（FCCSC），尽管它们表现出一定程度的枝内变异。来自维泰博地区的17个菌株位于系统树的较低部分，形成四个主要簇。第一个簇仅包含分离株FUS 25；第二个簇包括F. aconidiale的模式菌株以及先前归属于FTSC的分离株PT；第三组包括F. celtidicola和来自卢布林地区的内生分离株；第四组占据中间位置，包含F. juglandicola和来自克拉科夫地区的分离株。FCCSC及其相关分离株与其余菌株清晰分离，强化了它们与FTSC的区别。
这种分离得到所有三种独立物种界定算法的一致支持。实际上，mPTP和ABGD都将所有21个分离株归为一个物种级单元，而GMYC识别出三个不同的实体。第一个GMYC组包含单个NGN分离株（FUS 25），它形成了一个独立的谱系，与其在系统树中的独特位置一致。第二组包括八个意大利NGN分离株、所有波兰分离株以及鉴定为F. celtidicola和F. juglandicola的菌株。第三簇包含剩余的NGN分离株，包括分离株PT、分离株IHEM 28077和F. aconidiale的模式菌株。所有三种界定方法都一致承认F. citricola和F. salinense为 distinct 物种，但分离株ZLVG982的归属存在分歧。在ABGD分析中，该分离株与F. salinense聚在一起，而在mPTP和GMYC中，它形成了一个独立的谱系，支持了我们先前的推论，即它可能代表一个单独的、尚未描述的物种。
在FTSC内，三种算法基本一致， consistently 恢复了与F. acuminatum、F. tricinctum、F. torulosum、F. reticulatum、F. avenaceum和F. gamsii相对应的得到良好支持的枝。较小的分歧涉及F. iranicum、F. flocciferum和FTSC 24之间的区分，它们被所有三种界定方法归为一个分类单元，以及分离株FTSC 21，在GMYC分析中与F. avenaceum聚集成一个操作单元。同样值得注意的是FTSC 25，由一个单一菌株代表，它被置于一个中间位置，与FCCSC和其他FTSC谱系的系统发育距离似乎相等。
3.3 In-depth investigation of K2P genetic distance
来自ABGD分析的成对Kimura 2-参数（K2P）距离矩阵证实了FCCSC和FTSC物种复合群之间存在明显的不连续性。复合群间距离范围从0.0614到0.0955，中位数为0.0767，划定了一个清晰的条形码间隙，将两个复合群分开。相比之下，复合群内距离要小得多：FTSC内距离较高（Q3 = 0.0406，max = 0.0560），反映了与几个不同的、公认的物种级实体相关的更大的内部结构。FCCSC内的值仍然非常低，中位数为0.0036，Q3为0.0229，最大距离为0.0279。这些结果证实了两个复合群之间存在强烈的遗传分离，其组内和组间距离分布没有重叠。这种缺乏重叠代表了一个清晰的“条形码间隙”，定量地强化了FCCSC的 distinct 进化特性及其与FTSC的分离。
当深入探究FCCSC时，K2P距离矩阵揭示了一个 cohesive 但内部结构化的谱系，由四个遗传组组成：F. citricola、F. salinense、Fusarium sp. ZLVG982，以及一个更大的集合体，包括F. aconidiale、F. celtidicola、F. juglandicola和意大利及波兰分离株（称为“FCCSC综合分类单元，或FCCSC-CT”），这与我们之前的系统发育考虑一致。这些组内的成对距离 uniformly 较低，在F. citricola中未观察到变异（所有距离 = 0，表明这五个分离株在所分析的位点上是遗传 identical 的），在F. salinense（中位数 = 0.0048；最大值 = 0.0048）和FCCSC-CT分离株（中位数 = 0.0024；Q3 = 0.0036，最大值 = 0.0060）中观察到轻微的变异性。FCCSC内的组间比较也产生了非常低的分化，中位值范围在0.016到0.023 K2P之间。最小的组间距离记录在ZLVG982和F. salinense之间（中位数 = 0.0144），而最大的发生在F. citricola和F. salinense之间（中位数 = 0.0230）。FCCSC-CT consistently 显示出与所有其他FCCSC亚组的低分化（中位数 = 0.0168-0.0229）。它们的内部距离（中位数 = 0.0024）完全落在预期的种内范围内，而它们的组间分歧（0.017-0.023）表明是早期的物种形成而非已确立的分离。总的来说，这些数据表明FCCSC-CT构成了一个单一的、遗传上 cohesive 的谱系，与F. citricola、F. salinense和ZLVG982 distinct 但密切 related；它们共同形成了一个紧凑的物种复合群，其特征是浅的内部分歧和强烈的复合群间分离。
4 讨论
镰刀菌属包含一个高度多样化的植物病原体、内生菌和腐生菌集合，占据广泛的生态位。其显著的形态可塑性和隐蔽物种的频繁出现 long 使物种界定复杂化。传统的基于形态的鉴定通常不可靠，因为诊断性状可能随培养条件变化或在 distinct 分类群间重叠。分子工具的引入极大地 refined 了镰刀菌分类学，通过多位点系统发育方法 leading to 识别了几个主要物种复合群。然而，尽管有这些进展，许多最近描述的物种仍然基于有限数量的分离株，这引发了关于其定型的稳健性和物种边界稳定性的问题。
其中，FCCSC代表了最近界定且解析度最低的群组之一，其特征是低种间分歧和重叠的形态特征。在此框架内，本研究提供了对来自意大利和波兰与榛子相关的FCCSC分离株的综合评估，结合了形态学观察、系统发育推断和三种互补的物种界定方法。
与先前的不确定性一致，在分析的分离株中观察到形态变异，没有一个完全匹配F. celtidicola、F. juglandicola或F. aconidiale的原始描述。此外，不均匀的微形态特征与其系统发育分布没有 clear 对应关系。以F. celtidicola模式菌株为中心的簇包括缺乏小分生孢子和培养基着色的分离株，只有少数产生厚垣孢子。相反，与F. juglandicola相关的四个内生分离株都产生厚垣孢子，这是该物种原始描述中 absent 的特征。最后，与F. aconidiale相关的八个分离株与其形态特征最为一致，尽管它们表现出具有较低平均隔膜数的大分生孢子。
通过遗传距离和物种界定分析检查系统发育关系，并不支持当前FCCSC内这些物种之间的区分。在最近多样化的真菌谱系中划定物种边界 inherently 具有挑战性，特别是在像FCCSC这样的复合群中，低序列分歧、不完全谱系分选和可能的基因流可以模糊进化模式，正如在其他镰刀菌物种复合群中观察到的那样。为了探索这些边界，我们应用了三种互补的物种界定算法，ABGD、mPTP和GMYC，每种都基于 distinct 的理论和进化假设。尽管它们产生了部分不同的结果，但它们的 combined 结果提供了一个连贯的图景，即一个遗传上 cohesive 但内部结构化的物种复合群。
更保守的ABGD和mPTP方法识别了一个单一的物种级分类单元，包括FCCSC内的所有分离株，因为它们未能检测到FCCSC分离株内的任何显著间隙和分支速率变化，同时清晰地区分了两个复合群。
尽管GMYC模型设计用于使用单基因树推断物种边界，但它已被广泛用于使用 concatenated 位点定义几个分类群中的物种边界。在这里，GMYC将FCCSC-CT split 成三个亚组，最可能识别的是亚种群结构，而非真实分化的物种。这种更精细的细分与该模型对浅层种群水平分化的敏感性一致，并且在其他镰刀菌复合群中 frequently 报道，其中最近的多样化掩盖了清晰的物种边界。三种算法之间的不同结果反映了它们 distinct 的基本原理。虽然基于距离和速率的方法（ABGD和mPTP）强调清晰的遗传不连续性，但基于溯祖的GMYC对最近的分化和种群结构更敏感。GMYC观察到的轻微过度分割 similarly 在其他镰刀菌复合群中报道过。
K2P距离的定量分析独立支持了物种界定结果，证实了FCCSC和FTSC之间存在清晰的遗传间隙。复合群间距离比FCCSC内观察到的距离高出三倍多，强调了它们 distinct 的进化分离。
在FCCSC内，遗传变异仍然 minimal：组内距离比镰刀菌通常认可的种间阈值低一个数量级（中位数 = 0.002–0.005），表明强烈的内部 cohesion。识别出四个主要遗传簇，F. citricola、F. salinense、Fusarium sp. ZLVG982和广泛的FCCSC-CT集合。后一组显示出非常浅的分歧，与种内变异性一致，而非 distinct 的物种形成，这与GMYC结果一致。来自斯洛文尼亚的分离株ZLVG982占据了一个中间位置，表明是一个早期的谱系，可能反映了早期分化或有限的地理隔离。总的来说，ABGD和mPTP的一致结果，得到低K2P距离的支持，表明FCCSC代表了一个单系谱系，具有浅层但结构化的种内多样性。
然而，由于分析基于两个位点（tef1-α和rpb2）以及确定数量的意大利和波兰分离株，额外的基因组数据，连同跨宿主和区域的扩展采样，对于确定观察到的变异性是反映了早期物种形成还是最近多样化物种复合群内的多态性将是 essential。据我们所知，本研究 comprehensive 了当前归属于FCCSC内这三个问题物种的所有菌株。Fusarium juglandicola also 在波兰的槲寄生（Viscum album subsp. austriacum）叶片和患病的有梗栎（Quercus robur）幼苗茎部被鉴定出来， also 在斯洛伐克的Echium vulgare瘿蚊Asphondylia echii和悬钩子瘿蚊Lasioptera rubi的幼虫和瘿内被鉴定出来；不幸的是，GenBank中未提供将这些菌株纳入我们分析所需的一对标记序列。尽管有这些限制，从栽培和野生宿主收集的分离株的紧密遗传相关性表明FCCSC的成员分布广泛，并可能在榛子中共享一个内生阶段。与Costa等人最近的观察一致，许多先前归类为F. lateritium的菌株 likely 属于FCCSC，强化了进行全面分类修订和重新评估F. celtidicola、F. juglandicola和F. aconidiale之间物种边界的需求。
5 结论
本研究的结果为FCCSC的分类学提供了新的见解，证明当前接受的F. aconidiale、F. celtidicola和F. juglandicola之间的分离得不到分子和基于距离的证据支持。系统发育重建、物种界定分析（ABGD、mPTP和GMYC）以及成对K2P距离比较 consistently 表明这些分类单元，连同意大利和波兰分离株，形成了一个单一的、遗传上 cohesive 的谱系，其特征是浅层但结构化的种内多样性。虽然ABGD和mPTP收敛于一个物种级单元，但GMYC检测到有限的结构， likely 反映了种群水平分化或不完全谱系分选。
这些发现强调，尽管FCCSC与FTSC clearly distinct，但FCCSC内的内部多样化仍然低于镰刀菌通常认可的种间阈值。观察到的遗传 cohesion 表明，当前被视为 separate 物种的几个分类单元可能 instead 代表单一进化谱系的变体。更广泛地说，该研究说明，虽然某些镰刀菌物种复合群中的物种边界是 robust 且跨方法可重复的，但其他边界仍然模糊。这 underscore 了需要扩展分类单元采样和采用整合分子、形态和生态数据的综合方法。在这方面，基于距离和基于模型的物种界定算法为重新评估最近描述的
