《Frontiers in Systems Biology》：Metagenomics enables the first detection of Trypanosoma sp. in Streblidae (Diptera: Hippoboscoidea) parasitizing bats in S?o Paulo, Brazil
引言
蝙蝠是除南极洲外所有大陆均有分布的飞行哺乳动物，约占所有哺乳动物物种的20%，总数超过1400种，其起源估计可追溯到约6000万年前的始新世。蝙蝠提供了众多的生态系统服务，其保护对于维持绿地至关重要。尽管蝙蝠具有不可否认的生态重要性，但它们也被认为是众多对公共卫生重要的传染源的储存宿主，包括病毒、细菌和寄生虫，这凸显了在自然区域，特别是在当前剧烈气候变化的背景下，持续进行病原体监测以更好地了解这些病原体空间分布的必要性。
这些哺乳动物与其特有的吸血性外寄生虫——斯特布卢姆蝇科和蝙蝠蝇科的双翅目昆虫——保持着内在的联系。尽管这两类昆虫都与蝙蝠紧密协同进化，但与宿主物种的特异性共进化导致了各自独特的形态适应。这种密切的关系以及由此产生的适应性使得这些双翅目昆虫成为研究宿主-寄生虫协同进化的优秀模型。这些蝇类表现出显著的宿主特异性，并采用能最大化适应度的繁殖策略，包括在群体内切换宿主。这些行为特征，加上它们的专性吸血习性与蝙蝠宿主的密切接触，使这些外寄生虫成为病原体传播动态中潜在的参与者。许多斯特布卢姆蝇物种观察到的高宿主忠诚度，加上它们在栖息地内个体宿主间移动的能力，为病原体的垂直传播和水平传播创造了机会。此外，成虫的寿命长及其在整个生命周期中反复吸血，可能有助于病原体在蝙蝠群体内的获取、扩增和传播。这些生态和生物学特征是理解蝙蝠-外寄生虫系统中病原体传播网络的关键因素。斯特布卢姆蝇科包括约230个物种，主要分布于热带地区，其中在巴西记录了24属101种。
蝙蝠是克氏锥虫分支锥虫的天然储存宿主，并可能促进了其在各大洲间的传播。锥虫科包括锥虫属、利什曼属和短膜虫属，已知可在多种宿主中引起疾病。锥虫属引起两种具有重要医学意义的疾病：恰加斯病和非洲昏睡病。传播主要通过吸血无脊椎动物媒介进行，其中锥蝽是主要媒介。在巴西，已在蝙蝠中鉴定出克氏锥虫、朗氏锥虫、马氏锥虫、迪氏锥虫和瓦瓦乌锥虫等感染。
虽然此前未有在斯特布卢姆蝇中检测到锥虫的报道，但已在蝙蝠外寄生虫中发现了其他血液寄生虫。研究在蝙蝠蝇中检测到巴尔通体DNA，表明它们可能在蝙蝠种群内作为细菌性病原体的潜在媒介或机械传播者。此外，在蝙蝠蝇中发现了肝簇虫和其他顶复门寄生虫的分子证据，这强化了蝙蝠外寄生虫可能作为多种血液寄生虫的储存库或媒介的假说。这些发现共同强调了将蝙蝠蝇作为蝙蝠种群中循环的血源性病原体潜在哨兵进行研究的重要性。
这些蝙蝠蝇对宿主的强依赖性，使其在觅食和繁殖上都依赖于蝙蝠，这使它们有潜力作为传染源的实用哨兵。因此，本研究对这些蝇类进行了探索性宏基因组学研究，因为这种下一代测序分子技术无需预先了解目标病原体即可鉴定样本中包含的多种微生物。本研究的目的是报告在寄生蝙蝠的斯特布卢姆蝇科蝇类中首次检测并初步遗传表征锥虫属物种，为了解该寄生虫在圣保罗市peri-urban生态系统中分布的认知做出贡献。
材料与方法
这是一项基于2022年在巴西圣保罗收集的蝙蝠外寄生虫样本的探索性宏基因组学研究，旨在鉴定潜在的寄生虫DNA序列。
研究区域
样本于2022年8月在圣保罗北区佩鲁斯区的安汉盖拉野生动物保护区收集。该区域面积约800公顷，是北大西洋森林生态廊道的一部分，也是圣保罗市大西洋森林保护与恢复市政计划的优先区域。栖息地由再生的次生林组成，先前曾用作桉树种植园，并与保存完好的原生大西洋森林片段相连。
捕获与样本制备
蝙蝠在林冠下的地面层使用长10米、网孔50毫米的雾网捕获，于日落后布设，每晚从18:00到23:00每30分钟检查一次。捕获后，蝙蝠暂时存放在布袋中直至处理。经过鉴定和样本收集后，所有蝙蝠均在捕获地点安全放归野外。收集寄生在蝙蝠身上的斯特布卢姆蝇，并为其分配与各自宿主相同的识别号以保持追踪。蝇类储存于-80°C的冷冻管中，物种鉴定随后在实验室的-80°C冷台上进行，未使用任何保存缓冲液。标本（蝙蝠和蝇）均根据形态特征鉴定到物种水平。当从单一宿主收集到多个同种蝇时，将它们合并为池进行处理。样本经过70%乙醇10秒预处理以去除外部污染物，并用DNA/RNA-free水冲洗三次后，在含有350 μL磷酸盐缓冲盐水和3毫米不锈钢珠的L-beader 6细胞破碎仪中进行研磨。在19°C下以10,000 RPM离心10分钟后，上清液通过0.2微米过滤器。每150 μL样品加入7.5 μL蛋白酶K，随后在干浴中37°C孵育10分钟。使用Extracta - DNA and RNA Viral试剂盒按照制造商方案进行DNA和RNA提取。
宏基因组学方案
使用SMART-9N协议进行宏基因组测序。简言之，从样本中提取的遗传物质经Turbo-DNase处理，使用Zymo RNA Clean-up & Concentrator-5试剂盒纯化，并使用SuperScript IV合成cDNA。使用Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix和随机九聚体引物进行扩增，如SMART-9N协议所述，该协议能够对cDNA进行无偏倚扩增，而不针对特定分类群。使用Qubit 4荧光计测量DNA浓度，输入DNA量至少为50 ng的样本用于测序。使用Native barcoding V14试剂盒制备测序文库，并在GridION上使用R10.4.1流动芯片进行测序。FAST5文件转换为FASTQ格式用于生物信息学分析。
生物信息学
FASTQ序列在Geneious Prime软件中处理。使用BBDuk进行质量修剪，随后去除比对到人类基因组和外寄生虫宿主基因组的读段。过滤后，长度超过500 bp的读段使用基于比对的方法进行初步分类筛选，并与NCBI nt数据库进行比较。在此宏基因组筛选步骤之后，所有初步归类为锥虫属的读段被提取出来并进行BLASTn搜索以验证其分类学同一性，并在NCBI进行BLASTn验证。选择与分类读段相似度最高的锥虫物种作为最终比对步骤的参考。在整个提取、文库制备和测序过程中包含两个阴性对照，在这些对照中检测到的任何分类单元均被视为污染物并从所有下游分析中移除。
使用Tadpole进行重叠群组装，所得重叠群使用Minimap2比对到18S rRNA基因区域。该区域位于小核糖体亚基内，常用于系统发育研究和物种鉴定。计算描述性统计量和相对频率以支持所得序列的物种级分类。
使用MEGA12软件分两步进行系统发育推断。首先，推断一棵最大似然树，进行1000次自举重复。模型选择确定TN93 + G是该数据集的最佳拟合进化模型。该树包括本研究中获得的三个序列以及从GenBank检索的17个代表克氏锥虫分支中已描述锥虫物种的序列。
第二步，生成另一棵最大似然树，以检查新获得的锥虫序列相对于先前报道的未分类蝙蝠相关分离株的位置。该树使用最大似然法生成，进行1000次自举重复。在MEGA 12中，最佳拟合替代模型是Tamura–Nei + I。该策略用于探索巴西蝙蝠相关锥虫物种的多样性和进化关系。数据集包括本研究中生成的三个一致序列以及其他26个已鉴定的锥虫物种和多个先前在蝙蝠中检测到的未分类锥虫属分离株；所有序列均从GenBank检索。
使用布氏罗德西亚锥虫和一个爬行动物相关的锥虫谱系作为外群对树进行定根。选择这些外群是因为它们代表了属内早期分化的分支。它们系统发育上的远缘位置允许稳定的根放置，并避免哺乳动物相关分类单元之间的人为聚类，从而提高推断拓扑结构的可靠性。
分析的样本是在单次采样日中收集的，并基于先前表明存在锥虫的宏基因组学发现进行选择。在其他未检测到锥虫序列的日期采集的样本未纳入此分析。由于这是一个样本量小的初步数据集，未进行与其他感兴趣变量的统计关联分析。
结果
在采样日捕获的19只蝙蝠中，有6只被斯特布卢姆蝇寄生。对六个样本的分析显示，其中三个含有锥虫属的序列。
用于分类学鉴定的读段描述见相应表格。仅考虑长度超过500 bp的读段，以确保有足够的序列长度进行可靠的BLAST分类并最大限度地减少假阳性鉴定。在三个锥虫阳性的样本中，样本3和样本6各显示有20条超过500 bp的读段，而样本5显示的超过500 bp的读段数量大约增加了七倍。为了读段均一性，从样本"5"中随机选择60条读段，同时从其他每个样本中选择20条读段进行BLASTn分析。仅考虑查询覆盖度高于70%的读段进行物种级分类。
对读段的BLAST分析用于识别最接近的分类学匹配并选择用于比对的参考序列。因为一致性重建需要单一的参考来锚定读段，所以选择在BLAST命中中出现频率最高的物种——瓦瓦乌锥虫——用于此目的。然后将读段在核糖体基因的18S rRNA区域内与该参考序列进行比对，以生成单一的一致序列。
使用序列组装方法，我们获得了534 bp、823 bp和814 bp的片段。在系统发育分析中，本研究的序列形成了一个高自举支持率（98%）的单系群，在进化位置上比舒氏锥虫分支内的其他物种更接近瓦瓦乌锥虫。自举值高于70的显示在节点上，而本研究中的序列以红色突出显示。使用布氏锥虫和蜥蜴锥虫序列作为外群。
成对相似性分析支持了这三个序列靠近瓦瓦乌锥虫的系统发育位置。BLASTn搜索显示，瓦瓦乌锥虫是核苷酸同一性最高（97.4%–97.8%）的命名物种，而其他锥虫物种显示出较低的相似性值。更高的同一性分数（>98–100%）仅在分类为锥虫属（未命名）的序列中观察到，这些代表属水平的匹配。这些定量结果与系统发育树一致，在树中我们的序列与瓦瓦乌锥虫形成了一个支持良好的分支（93%自举值），表明了一种密切但独特的关系。
第二棵系统发育树仅包含蝙蝠锥虫属物种，纳入了Alves等人关于不可培养锥虫属序列的发现，这些发现描述了不同的分子操作分类单元，并将其分类为新蝙蝠分支1、2、3、4和5。还包括了文献中可用的其他巴西锥虫属序列，以确定新序列与Alves等人提出的分支的对齐情况。使用布氏罗德西亚锥虫和来自壁虎的锥虫属物种作为外群。
我们的系统发育分析证实了主要新蝙蝠分组的稳健性，新蝙蝠分支2的自举值为0.9，新蝙蝠分支2与新蝙蝠分支3之间关系的自举值为0.8，支持了5个不同谱系的结构。新蝙蝠分支4在自举值上显示出有趣的模式，基础节点具有稳健的统计支持（0.823和0.601），但内部分支的自举值相当低（0.003）。关于地理分布，新蝙蝠分支4存在于里约热内卢州，并且随着本次鉴定的三个新序列，也存在于圣保罗州。新蝙蝠分支3显示出更广泛的分布，包括来自帕拉伊巴州和里约热内卢州的样本。GenBank中可用的数据没有揭示属于新蝙蝠分支2的序列的地理位置信息，表明 deposited metadata 可能存在空白。
本研究中获得的部分锥虫属序列已存入GenBank，登录号为PV945502、PV945503和PV945504。
讨论
需要明确承认，此处呈现的结果是初步的，基于有限的样本量，这限制了研究结果的普适性，并阻碍了任何生态学或统计学推断。因此，所有解释都应谨慎进行，并需要更大、更多样化的样本集进行进一步调查。
本研究中对锥虫的检测得益于宏基因组学的无偏倚性，因为该寄生虫并非最初的研究重点，且此前从未在蝙蝠蝇样本中发现过。该技术的优势之一是其能够发现不可培养的生物体，从而更全面地了解环境中的寄生虫多样性。
仅凭宏基因组学检测并不能确认媒介能力或确立这些蝇类作为这些寄生虫的生物学媒介。斯特布卢姆蝇中锥虫DNA的存在可能代表来自宿主血液的短暂或残留物质，而非蝇类自身的活动性感染，在解释这些发现时必须承认这一区别。为了验证和深化这些发现，整合其他分子工具（如常规PCR）非常重要，并尝试培养较少研究的物种，然后进行测序。这种组合方法不仅有助于确认检测到的生物体的存在，还能为其存活能力和生物学产生重要见解，有助于更好地理解锥虫的生态学，尤其是在城市绿地中。
瓦瓦乌锥虫最初在朗多尼亚的帕内尔氏蝠蝠中描述，随后在帕拉州也有报道，与本研究中检测到的序列系统发育位置相近。这些序列是从寄生在卡罗利娅属蝙蝠的五个蝇样本中的三个中回收的。先前在里约热内卢州的大西洋森林、圣埃斯皮里图州和哥伦比亚亚马逊地区的研究也报告了与卡罗利娅属蝙蝠相关的锥虫。在圣保罗州，先前在蝙蝠中描述的物种包括克氏锥虫和马德拉锥虫。这是圣保罗州新蝙蝠分支4序列的首次报告。实验表明，瓦瓦乌锥虫显示不出感染哺乳动物体外培养细胞、小鼠或锥蝽的能力，并在后者的消化系统中被灭活。
在新蝙蝠分支的系统发育分析中，五个不同谱系的非单系分布可能表明该寄生虫的进化历史充满了多次独立适应蝙蝠寄生的事件，尽管这种解释需要更广泛的分类学采样和额外的分子标记来确认。自举值提供了不同程度的支持，新蝙蝠分支2及其与新蝙蝠分支3的关系作为支持良好的分类群脱颖而出，新蝙蝠分支3显示出从帕拉伊巴州到里约热内卢州的广泛地理分布，表明其具有更强的扩散能力或对不同宿主的适应性。新蝙蝠分支4表现出特殊的系统发育结构，具有稳健的基础节点但内部分支的自举值低，表明近期发生了分化事件。新蝙蝠分支1和新蝙蝠分支5显示出不同的模式，新蝙蝠分支1与瓦瓦乌锥虫存在密切的系统发育关系，暗示了可能的共享进化史和共同祖先。
Alves等人发现卡罗利娅属蝙蝠的锥虫形成了一个独特的谱系，即新蝙蝠分支4，可能对该属特异，这一假说得到了本研究中序列的加强。锥虫属新蝙蝠分支在巴西境内的描述表明这些寄生虫在南美洲分布更广，特别是考虑到它们在阿克雷州的存在，该州与秘鲁和玻利维亚接壤。需要在其他南美国家进行进一步研究以确定这种地理分布的真实范围。
锥蝽是经过验证的媒介，特别是洞穴蝽属物种，它们优先在洞穴中以蝙蝠为食。在一项对伦氏洞穴蝽的研究中，发现了形态类似于马氏锥虫的原生动物。此外，早在1942年，研究人员就记录了从作为蝙蝠栖息地的树洞中收集到的多毛洞穴蝽和斯特布卢姆蝇，表明存在持续的传播。最近，在圣埃斯皮里图州报告了携带迪氏锥虫的维氏锥蝽。
除了锥蝽，实验研究表明温带臭虫可以作为某些蝙蝠锥虫物种（如海氏锥虫和鼠耳蝠锥虫）的可能媒介。这些臭虫表现出类似于克氏锥虫在锥蝽体内的发育模式，这一点尤其重要，考虑到这些外寄生虫在城市蝙蝠栖息地中的高流行率及其维持传播循环的能力。
仅在与卡罗利娅属蝙蝠相关的瓜希罗斯特布卢姆蝇标本中检测到锥虫DNA可能反映了绿地区域中寄生虫-宿主-外寄生虫相互作用的复杂性。蝙蝠蝇中锥虫DNA的存在并不能确定其媒介能力或生物学传播。这一发现可能通过食果性蝙蝠偶尔摄入昆虫的机械携带、直接蝇类外寄生导致的血餐残留、或尚未了解的生态相互作用来解释。瓜希罗斯特布卢姆蝇和乔布林氏毛蛉蝇之间的分类学区别可能具有相关性，考虑到它们不同的寄生行为：瓜希罗斯特布卢姆蝇主要栖息和活动于宿主的毛皮中，而乔布林氏毛蛉蝇通常发现于膜表面，尽管关于寄生虫传播的生态学意义仍是一个需要进一步研究的假说。
蝙蝠的锥虫感染通常被认为是无症状的。然而，曾有描述一例与澳大利亚狐蝠锥虫病相关的临床病例，作者观察到溶血性贫血、黄疸和血红蛋白尿性肾病。病理学检查显示血液和淋巴组织中有大量病原体，并伴有轻度间质性肺炎和肝窦白细胞增多，提示存在系统性炎症过程。科学证据表明，蝙蝠具有独特的机制来耐受病毒引起的炎症，但对锥虫感染特异性炎症反应的调节仍知之甚少。
2011年从城市蝙蝠分离的克氏锥虫菌株数据显示对人类细胞具有感染潜力，尽管与已建立的菌株相比效率较低。尽管传播风险低，这一发现表明监测蝙蝠种群中的这些寄生虫仍然是一个相关的公共卫生问题。
气候变化和土地利用改变可以重塑蝙蝠与其外寄生虫之间的生态相互作用。这种变化可能有助于病原体溢出的出现，并改变锥虫传播的动态。
需要注意的是，关于蝙蝠锥虫的研究匮乏，尤其是新蝙蝠分支，限制了我们进行更全面解释的能力。对蝙蝠锥虫多样性进行补充表征对于扩展我们对这些寄生虫进化和生态学的理解非常重要。需要使用补充性分子标记（如gGAPDH和Cytb）以及更广泛的地理采样进行额外分析。此外，开发更灵敏的分子技术来检测未培养物种至关重要，类似于已在病毒分类学中成功使用的宏基因组学和宏条形码技术方法，以更好地理解该原生动物类群内部的进化关系。
结论
本初步研究报告代表了首次通过鸟枪法宏基因组学在寄生卡罗利娅属蝙蝠的斯特布卢姆蝇科蝇类中检测到锥虫属物种DNA。这项探索性研究也首次记录了圣保罗州大西洋森林中存在新蝙蝠分支4的锥虫属物种。对这种潜在的寄生虫-宿主-外寄生虫关联的识别表明需要持续监测这些生物体，特别是考虑到它们对蝙蝠健康的潜在影响和可能的公共卫生意义。鉴于有限的样本量（来自单次采样事件的n=6只蝇）和这种宏基因组学方法的探索性性质，目前尚不能得出更广泛的生态学解释。尽管需要进一步的研究，特别是涉及扩大采样、更深入的分子表征、媒介能力的实验验证以及生态相互作用的调查，但这一初步发现有助于记录该锥虫属物种分支在圣保罗大西洋森林的斯特布卢姆蝇中的出现，扩展了当前关于其地理分布的知识，为理解锥虫在蝙蝠及其外寄生虫间的传播提供了初步证据。
