综述：TMEM165在先天性心肌病中的推定作用

《Frontiers in Molecular Neuroscience》：Putative role of TMEM165 in congenital cardiomyopathies

本综述系统阐述了TMEM165在蛋白质糖基化（CDG）及先天性心肌病中的核心作用。文章聚焦于TMEM165作为高尔基体Ca2+/Mn2+/H+逆向转运蛋白的功能，解析其结构域、亚细胞定位及与SPCA1等离子的相互作用，强调其突变通过破坏离子稳态、糖基化过程及关键心脏蛋白（如离子通道、LAMP2）功能，最终导致多种心脏表型（如心肌病、瓣膜异常、心律失常）。文章还探讨了相关诊断策略（如血清转铁蛋白异构体分析）及潜在治疗方向（如半乳糖补充、Mn2+调控），为理解TMEM165-CDG的多系统临床表现，尤其是心脏病变提供了分子机制视角。

　　

TMEM165是先天性糖基化障碍及心肌病的推定角色

引言

在全球范围内，先天性心脏病是导致死亡和发病的重要原因之一。先天性心肌病是一类疾病，早期诊断和护理可改善生存率和健康状况。先天性糖基化障碍（CDG）是一组日益增多的遗传性多系统疾病，其特征是蛋白质和脂质糖基化缺陷。肥厚性/扩张性心肌病和神经肌肉异常是糖基化缺陷的常见表现。人类跨膜蛋白165（HsTMEM165）基因编码的蛋白属于未表征蛋白家族0016（UPF0016），其突变与CDG病例相关。本文综述了TMEM165相关的基础和临床研究进展，重点关注HsTMEM165变异的致病性，强调了氨基酸替换对维持TMEM165结构和功能完整性的关键作用及其与CDG患者表型的已知关联，并提出了这一快速发展研究领域的未来方向，以识别HsTMEM165在先天性心肌病中的潜在参与。

TMEM165是功能明确的未表征蛋白家族0016成员

进化上保守的TMEM165的结构和功能基序

HsTMEM165基因（HGNC:30760）位于染色体4q12，包含6个外显子，至少有12个转录本和204个直系同源物。该基因于2012年通过纯合子作图和表达分析在两名血清转铁蛋白等电聚焦试验异常（2型）并伴有特殊骨骼表型的同胞中发现。系统发育研究确定了两个高度保守的基序E-φ-G-D-[KR]-[TS]作为其共有模式。HsTMEM165多肽链预测包含6个跨膜螺旋片段（TMS）、4个腔域和3个胞质域。基序1（108ELGDKT113）面向胞质溶胶，而基序2（248EWGDRS253）暴露于细胞器腔面，后者预测参与转运功能。保守的酸性胞质环和预测的中心跨膜结构域中的残基对于钙耐受性和转运活性很重要。这两个保守基序中的天冬氨酸残基可能构成TMEM165的阳离子结合位点，在Ca²⁺和Mn²⁺转运中起关键作用。

TMEM165的翻译后修饰及其亚型的调控特征

HsTMEM165亚型1（Q9HC07-1）对应规范序列，亚型2（Q9HC07-2）是N端区域缩短63个氨基酸残基的多肽链。N端区域是UPF0016蛋白家族成员变异性最高的区域，该区域富含酸性和碱性残基，是一个推定的自抑制/调控结构域。Thr73和/或Thr80可能被钙或钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶磷酸化，从而产生抑制作用，这使得TMEM165能够响应Ca²⁺浓度的变化。分析还显示了沿序列的多个潜在可磷酸化残基以及泛素化位点。存在四个计算预测的HsTMEM165亚型序列，但它们可能因缺乏跨膜片段或家族共有模式而无功能。实验证明存在不止一种TMEM165剪接转录本亚型。129个氨基酸（D6RD79）和259个氨基酸（Q9HC07-2）的蛋白质亚型定位于内质网，而亚型1则定位于高尔基体。推测TMEM165剪接转录本可能以非常限制性和组织特异性的方式参与TMEM165亚型功能和亚细胞分布的精细调控。

TMEM165的相互作用组和运输伙伴

通过STRING、ComPPI和TFlink评估HsTMEM165与推定结构/功能伙伴的相互作用。TMEM165可能与TRIM25和CUL3参与泛素化及其随后的蛋白酶体降解。TMEM165功能障碍导致严重的N-连接糖基化缺陷，并通过功能相互作用与高尔基体SNAP受体复合物成员1（GOSR1）相连。TMEM165与高尔基体P型Ca²⁺/Mn²⁺-ATP酶（SPCA1）的内源性相互作用或其紧密的细胞内共定位已在Hap1细胞中通过邻近连接实验得到证实。当SPCA1缺失时，TMEM165会在溶酶体中组成性降解。共定位实验证实了HsTMEM165在高尔基体中的亚细胞定位及其在人类成纤维细胞和角质形成细胞中与SPCA1的共定位。TMEM165和SPCA/SERCA泵的相互作用影响细胞内Ca²⁺/Mn²⁺稳态的调控，这对肌肉收缩、蛋白质分泌和糖基化等许多基本细胞过程至关重要。对使用AlphaFold 2构建的TMEM165结构模型的分析表明，它可以与异源四聚体衔接蛋白（AP）复合物（AP1、AP2、AP3或AP4）相互作用，这与在分泌/内体-溶酶体系统内的动态循环一致。

TMEM165的亚细胞定位和组织表达

HsTMEM165被认为是人类细胞中唯一的高尔基体定位的Ca²⁺/H⁺逆向转运蛋白，主要是一种高尔基体驻留蛋白。但在质膜、内质网、核周、溶酶体、内体、分泌囊泡和几乎所有酸性胞质囊泡区室中也发现了显著部分。TMEM165在人类器官和组织中从胚胎期到成年期普遍存在。在心脏肌肉中，未分化的有丝分裂细胞池中HsTMEM165的表达富集程度比其分化的对应细胞高1.5倍。因此，强调TMEM165在胚胎发育以及组织更新、再生和修复过程中的重要性是合理的。心脏右心房的TMEM165表达高于左心室。目前没有可重复的证据表明TMEM165 mRNA或蛋白质在人类心血管疾病中与健康个体相比存在差异表达。但对于源自TMEM165的环状RNA（circTMEM165）存在明显差异，它促进内皮修复，暗示其在蛋白质编码基因之外的调控作用。

TMEM165转运功能的生理重要性

过去几十年证明了在整个进化过程中具有相同功能的蛋白质具有非凡的相似性。对人类细胞的膜片钳分析表明，HsTMEM165介导Ca²⁺转运，HsTMEM165的缺陷影响pH和Ca²⁺稳态。使用双离子作图和电生理学，证明TMEM165以pH依赖性方式将Ca²⁺输入溶酶体。在表达HsTMEM165的酿酒酵母和乳酸乳球菌中获得了TMEM165介导Ca²⁺和Mn²⁺内流、改变正常蛋白质糖基化的直接生化证据。使用荧光探针也清楚地证明了HsTMEM165直系同源物的Ca²⁺和Mn²⁺转运能力。在酵母和细菌CDG模型中获得了TMEM165在Ca²⁺和Mn²⁺解毒途径中防止胞质溶胶中有毒积累的重要性的实验证据。Reinhardt及其合作者在一项复杂的研究中证明了TMEM165在乳汁Ca²⁺分泌中的作用。在快速胆碱能突触中，Ca²⁺会短暂积累在突触囊泡中，随后很可能通过胞吐作用从末端清除。脑突触囊泡以两种主要方式积累Ca²⁺：通过一种P型Ca²⁺-ATP酶和一种由V型H⁺-ATP酶供能的Ca²⁺/H⁺逆向转运体。Ca²⁺/H⁺逆向转运体的激活影响分泌囊泡中的神经递质储存。

TMEM165与分泌途径中质子泵的能量耦合

分泌系统是驱动膜融合的能量库。V型H⁺-ATP酶（质子泵）是pH依赖性膜运输过程、分泌囊泡生物发生和刺激-分泌耦合范式中的能量转换器。为了确保Ca²⁺向具有酸性腔pH的细胞器中的次级主动转运，Ca²⁺/H⁺逆向转运蛋白（TMEM165）和质子泵必须在同一膜区室共表达。V型H⁺-ATP酶a亚基的不同亚型在高尔基体反面、分泌颗粒和质膜（a1）、高尔基体顺面和早期内体（a2）、溶酶体、分泌颗粒和质膜（a3）以及质膜（a4）中被检测到。Ca²⁺/H⁺逆向转运的特征类似于酵母和植物细胞液泡中的钙转运，以及克氏锥虫和其他寄生虫中主要的细胞内钙储存器-酸性钙体中的钙转运。为Ca²⁺/H⁺逆向转运供能的V型ATP酶的多肽组成和四元结构显示出显著的系统发育保守性。在同一细胞膜中共存由V型H⁺-ATP酶供能的阳离子-ATP酶和阳离子（Ca）/H逆向转运蛋白是一个常见的观察结果，这可能构成所有具有酸性腔pH的细胞器进行二价阳离子转运的基本功能单元。与上述与SPCA1的相互作用一致，在小鼠乳腺组织中报道了TMEM165和SPCA1（分泌途径的Ca²⁺-ATP酶）的细胞内分布之间存在显著匹配。

糖基化也受细胞内Ca²⁺浓度生理振荡的影响，因为Ca²⁺通过其在膜融合中的作用以及参与糖基化的酶的活性和稳定性而至关重要。Ca²⁺在许多信号通路中也起主要作用。Gdt1p的缺失会损害酵母中响应盐胁迫的Ca²⁺介导的信号传导。Gdt1活性受钙调磷酸酶（一种Ca²⁺/钙调蛋白激活的Ser/Thr蛋白磷酸酶）负调控。在HsTMEM165缺陷患者的软骨细胞和成纤维细胞中，TGFβ/Smad2和BMP信号通路功能受损。

TMEM165在pH稳态和糖基化运输中的作用

TMEM165通过其转运活性与糖基化相关联。许多糖基转移酶需要Mn²⁺作为辅因子。糖基化缺陷可能归因于阳离子浓度平衡的紊乱。有趣的是，同基因的TMEM165敲除人胚肾细胞（被认为是CDG模型系统）在揭示铁可以挽救糖基化缺陷方面很有价值。除了调节pH稳态外，由于被酸性细胞内区室吸收的阳离子与H⁺交换，TMEM165可以确保消除由糖基化和其他代谢过程产生的质子超载。Zajac及其合作者通过在不同细胞类型中使用互补技术测量跨细胞内生物膜的离子通量，明确证明了TMEM165在细胞内pH动力学中的重要性，即其作为质子激活的溶酶体Ca²⁺输入蛋白的作用。因此，在稳定转染的HeLa细胞中也描述了通过TMEM165的溶酶体H⁺外流使溶酶体周围区域酸化（维持其pH显著低于平均胞质溶胶pH值）。这项研究还清楚地表明，TMEM165是响应游离胞质Ca²⁺浓度升高的溶酶体H⁺泄漏所必需的，其过表达通过引起整个胞质溶胶的酸化来扰乱细胞pH稳态。

糖基化是单糖依次添加、结合和修剪以用分支聚糖结构修饰蛋白质的复杂过程。蛋白质合成后，必须通过内质网、不同的高尔基体区室和反式高尔基体网络进行运输，以被糖基化并靶向最终目的地。有效的蛋白质糖基化和运输需要每个高尔基体区室以及沿分泌途径的严格pH调节。当然，pH稳态的失调必然导致蛋白质糖基化缺陷。

预测CDG患者中HsTMEM165突变诱导的心肌病

TMEM165功能结构域的脆弱性

在蛋白质水平确认的2500多个HsTMEM165基因突变中，只有不到30%可预测为良性。这并不奇怪，因为前面分析的TMEM165的细胞功能使我们能够预见其广泛的生理相关性。描述的大多数突变是错义类型（约70%），而终止密码子获得型突变不到4%。提前引入终止密码子导致蛋白质功能丧失，和/或可能有助于产生具有改变功能特性的转录变体。

在组成HsTMEM165序列的所有氨基酸残基中都描述了突变。那些已被确认为致病性的突变主要存在于胞质结构域和跨膜片段中。考虑到功能结构域，致病性突变集中在家族基序1和2中，那里所有氨基酸残基都至少有一个致病性突变。此外，在溶酶体靶向信号中，75%的突变氨基酸残基与病理状况相关。这些发现表明对阳离子/H⁺逆向转运活性和HsTMEM165的亚细胞分布都有深远影响。

Foulquier及其合作者首先证明HsTMEM165缺陷会损害蛋白质N-连接糖基化。随后，注意力主要集中在HsTMEM165突变体在高尔基体糖基化中的功能、它们的表达水平、亚细胞定位以及响应Mn²⁺过载的溶酶体降解靶向。现在焦点将放在HsTMEM165突变的变异特异性机制及其影响心脏功能的下游效应上。

核苷酸胞嘧啶在谷氨酰胺密码子CAG中被胸腺嘧啶替代（151C > T）产生琥珀密码子（UAG）。因此，无义（NM_018475.5:c.151C > T）和非编码转录变体（NR_073070.2:n.384C > T）已被纳入与ADRB1多态性相关的ClinVar数据库中。ADRB1基因编码β₁-肾上腺素能受体，这是一种糖蛋白。该受体是心脏中主要的β-肾上腺素能受体，激活时会增加窦房结、房室结和心室肌的放电，导致心率增加、收缩力增加和心肌松弛增加。

家族基序1（E108LGDKT113）中的错义突变Glu108 > Gly（gAa/gGa）被证明会引起糖基化缺陷，并降低突变蛋白转运Ca²⁺和Mn²⁺的能力，而不改变对这些阳离子的亲和力。在TMEM165敲低的HeLa细胞中观察到的糖基化缺陷仅被HsTMEM-Glu108 > Gly的表达部分恢复，该突变体正确定位于高尔基体，并且对Mn²⁺诱导的溶酶体降解部分抵抗。在一名心脏功能障碍患者的HsTMEM165序列分析显示，其外显子2中存在c.323 A > G错义突变的纯合性。相同的突变在父母双方均以杂合状态存在。因此，家族基序1中其他进化保守氨基酸残基（即带负电荷的Asp111、大分子带正电荷的Lys112和极性Thr113）以及邻近的大分子疏水芳香族Phe114被小分子脂肪族甘氨酸替代的错义突变，会损害溶酶体相关膜蛋白2（LAMP2）的糖基化。值得注意的是，TMEM165缺陷导致LAMP2糖基化缺陷，其特征是存在异常的部分糖基化形式。LAMP2是丹农病中缺陷的基因，这是一种X连锁溶酶体贮积症，其特征是严重的心肌病、空泡性肌病和智力缺陷。丹农病是由LAMP2本身的缺失引起的，而不是糖基化缺陷，但在TMEM165缺失细胞中观察到的LAMP2糖基化不足表明TMEM165功能障碍可能间接影响与心脏病理相关的溶酶体蛋白。这些症状是几种先天性心脏疾病共有的，例如肌原纤维肌病4型、扩张型心肌病1X和2F，以及早发性肌病伴致命性心肌病，其致病基因分别是LDB3、FKTN、BAG5和TTN。LDB3基因突变也与肌营养不良症和几种心肌病相关。LDB3基因编码LIM结构域结合蛋白3，也称为Z带交替剪接PDZ基序蛋白，是一种含Zn²⁺的肌节Z线蛋白。FKTN基因编码高尔基体的单次跨膜II型膜蛋白，福山蛋白。该酶催化核糖醇5-磷酸串联重复序列形成的第一步，该重复序列将磷酸化的O-甘露糖基三糖与由3-木糖基-α-1,3-葡萄糖醛酸-β-1重复序列组成的配体结合部分连接起来。在MCK-Fktn-cKO小鼠中，急性消除福山蛋白导致严重的心脏功能障碍和加速的死亡率，伴有肌细胞收缩功能障碍和紊乱的高尔基体-微管网络。这项研究强调了蛋白质糖基化在维持肌细胞生理学从而预防心力衰竭方面的关键作用。BAG5伴侣蛋白提高心肌细胞存活率，并在由于钙耗竭、缺血和氧化应激导致内质网中缺陷蛋白质积累的心脏应激中具有保护作用。TTN基因编码心脏肌节的重要组成成分肌联蛋白。它是一种非特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，需要二价阳离子和钙调蛋白才能完全激活。

位于第一个跨膜片段和胞质结构域过渡处的氨基酸残基构成溶酶体靶向信号Y124NRL127。溶酶体靶向信号中的致病性突变破坏从高尔基体的退出，延迟网格蛋白介导的内吞作用，并扰乱内体-溶酶体离子稳态，改变细胞中的离子处理。突变Tyr124 > Ser和Tyr124 > Phe主要影响HsTMEM165的亚细胞定位。显然，这些突变体无法从高尔基体退出。在Gdt1缺陷酵母中表达的野生型HsTMEM165存在于高尔基体区室、质膜和晚期内体/溶酶体内。突变体Tyr124 > Ser主要积累在高尔基体区室，在质膜上检测不到，而突变体Tyr124 > Phe在Gdt1缺陷酵母中的表达显著降低。位置126的精氨酸在系统发育上严格保守，所有可能的单核苷酸变异都是致病性突变。这些突变延迟了HsTMEM165通过网格蛋白介导的内吞作用的内化。因此，在从CDG患者分离的成纤维细胞中以及通过自然人类变体在lci-1 +/-线虫中的表达证明，除了异常的细胞内定位外，离子稳态也发生改变，主要是在溶酶体和内体中。TMEM165的亚细胞定位也受到挑战。这项研究表明，位于大胞质结构域（Arg173-Lys228）位置198-200和208-210的精氨酸（一种大的带正电荷的氨基酸残基）不参与蛋白质表达，也不参与其高尔基体定位或Mn²⁺诱导的TMEM165降解。在纯合子和杂合子CDG患者中报道了HsTMEM165多肽链第126位精氨酸的突变，并伴有家族史。有趣的是，在TMEM165多肽链第127位用甘氨酸替代大氨基酸亮氨酸对亚细胞定位没有影响。相反，这种突变降低了TMEM165在高尔基体阳离子摄取过程中对Ca²⁺的亲和力，而不影响对Mn²⁺的亲和力。然而，在表达野生型和突变变体的乳酸乳球菌中评估TMEM165转运活性的动力学分析时，未证实这种效应。

在CDG患者中报道的家族基序2（E248WGDRS253）中的自然突变似乎特别多面化。突变体Glu248 > Ala的过表达严重损害HeLa细胞中的Ca²⁺转运。Glu248对蛋白质糖基化也至关重要，因为突变体Glu248 > Gly无法恢复LAMP2糖基化。用甘氨酸替代Asp251、Arg252、Ser253和Gln254在亚细胞错误定位和对高Mn²⁺诱导的溶酶体降解的敏感性方面产生异质性结果。第六个跨膜片段第304位的甘氨酸在系统发育上严格保守。在一名复合杂合患者中检测到突变体HsTMEM165。这种错义突变没有改变TMEM165在高尔基体中的定位，但突变的TMEM165对Ca²⁺的亲和力降低，而对Mn²⁺的亲和力保持不变。因此，它在从HsTMEM165缺陷患者分离的成纤维细胞中引起溶酶体和内体区室的酸化。

TMEM165和糖组对Ca²⁺处理及离子通道活性的影响

全文提供了几条线索，说明HsTMEM165如何对心肌细胞的收缩活动重要，以及其致病性突变如何导致相关心肌病。更重要的是，TMEM165是哺乳动物细胞酸性细胞器中唯一的高容量、低选择性的Ca²⁺/H⁺逆向转运蛋白。因此，它应在确保心肌细胞中Ca²⁺处理和收缩性的复杂机制中发挥基本作用。除主要的D-肌醇1,4,5-三磷酸可动员的Ca²⁺池外，来自广泛系统发育范围的不同生物体的内部Ca²⁺储存也可以被环状ADP-核糖和烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸动员。这些Ca²⁺动员剂密切相关，因为相同的代谢酶ADP-核糖基环化酶/环状ADP-核糖水解酶1可以在适当条件下合成它们中的任何一种。这表明一个统一的机制可能调控这两条通路。有趣的是，该酶包含至少三个N-糖基化位点，并且NAADP在pH 5.0时的产量远高于pH 7.4。NAADP诱导心肌细胞内质网中的Ca²⁺释放。这又被L型钙通道阻滞剂和巴弗洛霉素A1（一种选择性V型H⁺-ATP酶抑制剂）抑制，而不受IP₃或兰尼碱通道抑制剂的影响。三种Ca²⁺动员第二信使IP₃、cADPR和NAADP同时参与细胞内Ca²⁺信号的形成和塑造。这一特征反映了需要严格控制细胞内Ca²⁺波的空间和时间传播，以对不同细胞外信号给出适当的生理反应。心肌细胞中的Ca_V1.2 L型钙通道对正常心脏功能至关重要，在兴奋-收缩偶联和动作电位时程中起关键作用。这些通道介导Ca²⁺内流，启动由其细胞内储存库（包括HsTMEM165）确保的细胞内Ca²⁺瞬变，最终导致肌肉收缩和随后的舒张。此外，Ca_V1.2亚基的表面表达和功能受N-连接糖基化修饰。

TMEM165缺陷扰乱高尔基体Mn²⁺/Ca²⁺稳态，并广泛破坏糖基化，这是蛋白聚糖、糖脂和神经节苷脂代谢的关键步骤。糖基化不足合理地扰乱神经元兴奋性和癫痫发作阈值，这在CDG患者中观察到。N-连接糖基化调节电压门控Na⁺、K⁺和Ca²⁺通道的运输和门控，以及大脑中最丰富的兴奋性和抑制性神经递质的配体门控受体。此外，TMEM165缺陷也以Mn²⁺依赖性方式破坏必需糖胺聚糖的生物合成，导致神经元周围网络功能障碍，可能有助于异常兴奋性和认知缺陷。糖鞘脂，特别是占大脑中所有聚糖80%和>75%唾液酸的神经节苷脂的半乳糖基化不足，必将影响郎飞结和髓鞘的组织，这对动作电位传导和白质发育至关重要。

最近，通过多孔石墨化碳液相色谱与质谱联用生成了包含265个N-和O-连接聚糖的人类心脏糖组参考结构库。细胞类型特异的心肌细胞N-糖组富含高甘露糖结构，并在分化过程中显著重塑，而O-连接聚糖谱几乎保持不变。蛋白质糖基化途径有助于定义动作电位在心脏中如何传播，因为钙、钾和钠离子通道是细胞表面糖蛋白。例如，已经完美地证明了阻断N-聚糖与I型跨膜K⁺通道KCNE1的β亚基的结合如何阻止其正确插入膜以形成产生缓慢激活的心脏Iks电流的功能性K⁺通道。

TMEM165-CDG病例报告中的心脏发现

预计会有持续增加的实验证据支持HsTMEM165基因的突变是许多先天性多系统疾病和综合征的病因。极为重要的是，ClinVar中可用的突变HsTMEM165序列是种系来源的，意味着它们可以遗传给后代。

现重点介绍那些症状和家族史已有充分记录的CDG患者的突变。近亲父母所生的两个孩子患有HsTMEM165缺陷，第一个在5个月大时死亡，另一个出生时患有心脏缺陷。超声心动图显示心尖部空间隔小缺损、卵圆孔未闭和动脉导管细小未闭，伴有轻度右心室肥厚体征。这是一个记录特别完整的临床病例，因为一个已确诊的兄弟姐妹允许进行产前诊断并从出生开始随访。出生后仅3分钟，就已经观察到异常的糖基化模式，其特征是 tri-、di-和单唾液酸转铁蛋白量增加，而四和 tri-唾液酸转铁蛋白仍构成最大部分。在接下来的几周内，转铁蛋白谱变为唾液酸化程度较低的形式，然后变为半乳糖基化不足的形式，导致几乎完全失去四唾液酸转铁蛋白。从第9周开始，半乳糖和唾液酸残基以同等比例缺失，表明半乳糖基化受损。O-连接糖基化也从出生起就受损，模式随时间恶化，直到患者因肾病综合征死亡。TMEM165-CDG患者中报告的心脏缺陷病例范围从严重和致命（如前所述）到中等和轻微改变，甚至由于过早死亡而无法检测。一名患有HsTMEM165纯合深内含子突变（Gly182 > Ala）的患者，具有CDG症状，血清转铁蛋白为2型模式，血清载脂蛋白C-III阴极偏移，在14个月大时，除超声心动图上可见少量心包积液外，心脏形态和功能正常。

当今诊断中TMEM165的定位

对于TMEM165-CDG，有