《Frontiers in Genome Editing》：CRISPR/Cas9-based programmable genome editing in chickens: concepts, applications and regulatory issues
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本综述系统阐述了CRISPR/Cas9技术在鸡基因组编辑中的原理与应用前景。文章详细介绍了该技术如何通过引导RNA（gRNA）与Cas9核酸酶靶向特定DNA序列，诱导双链断裂（DSB），并通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）机制实现基因敲除（Knock-out）、敲入（Knock-in）及精准调控。其在增强禽流感（AIV）和马立克氏病（Marek’s disease）抗性、提升生长速率与产蛋性能、实现早期胚胎性别鉴定以解决雄性雏鸡淘汰伦理问题、调控繁殖性状、以及利用鸡蛋作为生物反应器（Bioreactor）生产治疗性蛋白（如人脂联素ADPN、干扰素-β hIFN-β）等方面展现出巨大潜力。同时，文章也探讨了CRISPR激活（CRISPRa）与CRISPR干扰（CRISPRi）等衍生工具的应用，并分析了相关的伦理与监管挑战。
引言
随着人口增长和对食物营养需求的急剧增加，优质畜禽生产面临着巨大压力。鸡作为最重要的家禽之一，是蛋白质和营养物质最廉价的来源。然而，禽流感病毒（Avian Influenza Virus, AIV）等疾病的突然爆发给经济和国家乃至国际层面的宝贵种质资源造成了不可逆转的损失。目前，尚无有效方法应对此类疾病爆发，活禽仍易受病毒攻击。在此背景下，鸡及其他禽类的基因组编辑技术已成为遗传研究和农业创新领域的突破性工具。
鸡细胞中的可编程基因组编辑
精准基因组工程（Precision Genome Engineering, PGE）工具能够快速、精确地修改家禽基因组，开启了家禽靶向育种的新时代。这些工具不仅能导致基因功能丧失，还能通过诱导DNA双链断裂（Double-Strand Break, DSB）促进同源重组（Homology-Directed Repair, HDR）。目前，已经能够将种内或种间单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs）引入鸡品系以增强其生产力。转基因技术，包括慢病毒载体、piggyBac转座以及睡美人系统，促进了外源基因表达动物的开发。而CRISPR/Cas9系统的出现使得精确编辑基因组信息变得更为简便。
成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）：第三代基因组编辑工具
CRISPR及其相关的Cas9蛋白代表了第三代可编程基因组编辑工具。CRISPR和Cas9是原核生物DNA组成部分，在细菌免疫系统中起关键作用，帮助消除转导、接合或转化的外源DNA。CRISPR/Cas9系统识别并诱导靶DNA序列中的DSB，与锌指核酸酶（ZFN）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）不同，它不需要成对单元来诱导DSB。其靶向特异性通过gRNA-DNA碱基配对和Cas9对原间隔区相邻基序（Protospacer Adjacent Motif, PAM）的识别来实现。CRISPR/Cas9通过质粒系统递送，Cas9和gRNA会瞬时表达并在48-72小时内降解，不留下永久性的遗传足迹。
CRISPR/Cas9与鸡基因组改变：来自体外研究的证据
CRISPR/Cas9基因组编辑技术的出现彻底改变了遗传工程领域，特别是在鸡基因组中实现精确高效的改变。与传统方法相比，CRISPR/Cas9为禽类（包括作为农业进步和生物医学研究关键模型生物的鸡）的靶向诱变提供了一个可编程且强大的平台。研究显示，在DF-1细胞中，针对过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）、ATP合成酶ε亚基（ATP5E）和卵清蛋白（OVA）基因的编辑效率高达95%。CRISPR变体如Cas9-D10A切口酶、通过同源介导末端连接（HMEJ）的位点特异性整合以及同源重组也在体细胞中取得了高达100%的编辑成功率。除了DF-1细胞，类似的应用也见于原始生殖细胞（Primordial Germ Cells, PGCs）和胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells, ESCs）等其他细胞类型。
具有特殊功能编辑鸡的培育
在哺乳动物系统中，胚胎收集和体外操作相对直接，而鸟类中的CRISPR/Cas9基因编辑策略则依赖于PGCs的分离、体外培养和增殖，随后进行遗传修饰并注射到发育中的受体胚胎血液中。这一多步骤过程大大限制了基因组编辑鸡的产生效率。通过CRISPR介导的PGCs同源重组已成功实现鸡的种系基因编辑。例如，通过电穿孔介导的CRISPR/Cas9机制对早期鸡胚胎进行功能丧失研究，敲除了神经嵴发育中的关键转录因子Pax7和Sox10。针对CXCR4基因的移码突变研究揭示了其在家鸡PGCs迁移中的作用。基于腺病毒的CRISPR载体也成功产生了MSTN和黑色素亲和素（melanophilin）敲除，以研究鸭和鸡中的功能丧失。
CRISPR变体、细胞类型和靶基因决定编辑效率
CRISPR/Cas9基因组编辑的效率在不同鸡细胞类型、递送平台以及编辑策略之间存在显著差异。在DF-1成纤维细胞中，突变效率范围从25%到近100%，而在PGCs中则为0%至100%。DF-1细胞特别适合CRISPR/Cas9诱变，在使用嘌呤霉素富集等选择方法后，突变率高达95%。PGCs作为种系前体细胞，具有独特的细胞环境，其染色质可及性、细胞周期时序和先天的DNA损伤反应机制在决定CRISPR干预结果方面起着关键作用。将传统CRISPR/Cas9与D10A切口酶变体和同源重组相结合，可将编辑效率提高到100%。使用替代报告基因或可选择标记物（如双报告系统）可以富集成功编辑的细胞，将核酸酶诱导突变的表观频率提高至41.9%。抗生素选择策略是决定鸡细胞中基因组编辑事件成功的主要因素。
CRISPR/Cas9介导的基因组编辑在家禽中的应用
基因组编辑技术彻底改变了遗传学研究，使研究人员能够以前所未有的精确度解析和操作基因组。在家禽中，CRISPR/Cas9技术已成功应用于多种场景。
CRISPR介导的体细胞操作
CRISPR/Cas9核酸酶已广泛用于鸡体细胞和胚胎细胞。通过使用富集系统，在鸡DF-1体细胞和胚胎干细胞中实现了PPAR、ATP5E和OVA基因的有效基因破坏。通过直接电穿孔在早期羊膜胚胎体节中实现PAX7基因的体内破坏也有报道。这些研究显示了15%至41%不等的敲低效率，主要与转染方法和细胞系统有关。
仅产生雌性后代
由于雄性蛋鸡的肉用生长效率低下，刚孵出的雄性雏鸡在孵化后不久即被扑杀，引发了严重的伦理和经济问题。基因编辑通过将标记基因插入Z染色体提供了有前景的解决方案。最近开发的“圣杯”（Holy Grail, HG）系统通过将遗传构建体插入Z染色体，选择性阻断雄性胚胎发育。经过蓝光处理的鸡蛋仅产生健康的雌性雏鸡。该系统确保了100%的雄性消除，与孵化场实践无缝衔接。
提高鸡的生长速率
肌肉生长抑制素（Myostatin, MSTN）是TGF-超家族成员，是骨骼肌发育过程中肌生成的已知负调控因子。MSTN的缺失会导致骨骼肌过度生长。使用CRISPR/Cas9 D10A切口酶变体成功编辑了鸡MSTN基因，导致体外MSTN蛋白表达缺失，以及体内鸡表现出胸部和腿部肌肉质量增加，同时腹部脂肪沉积减少。
揭示鸡蛋过敏的原因
鸡蛋过敏是儿童中最常见的食物过敏，影响高达2%的人口。卵类粘蛋白（Ovomucoid, OVM）和卵清蛋白（Ovalbumin, OVA）是鸡蛋中的主要过敏原。通过TALEN诱导PGC突变，成功创造了针对OVA基因的特异性基因敲除鸡。通过使用编码Cas9、单向导RNA（sgRNA）和耐药性基因的质粒转染鸡PGCs，并经过短暂的抗生素选择，高效地（>90%）诱变了OVA和OVM基因。移植突变OVM的PGCs到受体鸡胚胎中，产生了OVM基因破坏的纯合子和杂合子。这些过敏原编码基因纯合突变母鸡所产的蛋，对于鸡蛋过敏者可能是可耐受的。
鸡蛋生化成分的修饰
通过靶向卵巢中极低密度脂蛋白（VLDL）等关键调节因子，可以改变鸡蛋的脂质含量。前蛋白转化酶枯草溶菌素9（Pcsk9）在调节胆固醇水平方面发挥作用，该基因已通过CRISPR/Cas9成功敲除，效果持续6个月。通过同时破坏PGCs中的多个过敏原基因，可以更快地培育出产低过敏性鸡蛋的母鸡。
培育具有内在疾病抗性的鸡
家禽疾病爆发对商业家禽业构成严重威胁。基因编辑是禽类疾病抗性最有前景的方法之一。通过精确、靶向破坏tva、tvb和chNHE1受体基因，可以增强对ALV亚型A、B和J的抗性。鸡ANP32A（chANP32A）蛋白是AIV聚合酶活性的物种特异性宿主因子。通过基因编辑技术替换chANP32A基因为人源ANP32A（huANP32A）基因，可能降低AIV在鸡细胞中的聚合酶活性，赋予鸟类疾病抗性。比较鸡和鸭的基因组学也为疾病抗性基因编辑靶点提供了线索。
增强气候适应力
热应激等气候变化显著影响家禽生产和产品质量。利用CRISPR/Cas9技术精确调控热休克蛋白（HSP70, HSP90）和甲状腺激素受体等热响应基因的表达，可以增强鸟类在热应激下维持细胞功能的能力。对尼日利亚本土鸡的基因组分析已鉴定出包括热激转录因子1（HSF1）和缺氧诱导因子3α（HIF3A）在内的关键耐热性和免疫反应基因。
鸡蛋表达的生物制药与CRISPR/Cas9在禽类生物反应器中的作用
禽类生物反应器已被探索用于在鸡蛋中生产特定的重组蛋白。将CRISPR/Cas9基因组编辑系统与具有种系能力的PGCs相结合，允许外源基因在卵巢细胞中靶向整合和表达，并在蛋清中表达，通常在卵清蛋白（OVA）启动子的控制下，每蛋产量可达0.5-3.4毫克蛋白质。通过敲入（Knock-in, KI）策略，将cDNA构建体通过CRISPR/Cas9系统精确引入PGCs，可以产生种系嵌合公鸡，进而培育能产下含目标蛋白鸡蛋的转基因母鸡。近期进展包括生产具有胰岛素抵抗治疗潜力的人脂联素（ADPN），以及人干扰素-β（hIFN-β）。增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和绿色荧光蛋白（GFP）也已被成功生产作为遗传修饰的视觉标记。
CRISPR激活（CRISPRa）与CRISPR干扰（CRISPRi）
CRISPRa和CRISPRi使用催化失活的Cas9（dCas9）变体，能够以可控和可逆的方式开启或关闭基因表达，而无需改变DNA序列。CRISPRa将dCas9与转录激活域（如VP64, VPR, p300）融合，刺激基因表达；CRISPRi将dCas9与抑制域（如KRAB）融合，抑制基因表达。近期研究已在鸡DF-1成纤维细胞中高效使用了CRISPRa和CRISPRi。gRNA相对于转录起始位点（TSS）的位置显著影响激活和抑制的效率。扩展的CRISPR工具包为开发具有更高生产力、疾病抗性和定制鸡蛋成分的动物提供了潜力。
CRISPR/Cas9的伦理问题与监管批准
农场动物基因组编辑的进步伴随着一系列复杂的伦理和监管挑战。全球各国对基因组编辑生物体（包括鸡）主要采取了两种监管框架：基于过程的监管体系和基于产品的监管体系。欧盟等地采用基于过程的系统，任何通过基因组编辑技术产生的生物体都受到严格的转基因生物（GMO）法规管辖。美国、阿根廷等地则采用基于产品的系统，监管重点在于最终生物体的特性，如果编辑生物体不含有外源遗传物质，则可能不被归类为GMO。安全风险评估、脱靶效应、对动物健康和环境的长期影响以及公众接受度是监管考虑的关键。各国监管环境的差异影响了全球研究合作、商业化战略和消费者对基因组编辑动物的接受度。
结论
家畜基因组编辑代表了农业科学的一次变革性飞跃，有望显著提高动物养殖的效率、可持续性和福利。利用CRISPR-Cas9等尖端工具，科学家现在可以对鸡等家畜物种进行精确的遗传修饰，以改善疾病抗性、生长速率、繁殖效率和肉品质等性状。该技术不仅有望提高生产力并减少畜牧养殖的环境足迹，还为应对粮食安全、食品安全和气候变化等全球挑战开辟了新途径。同时，基因组编辑鸡对人类的影响是多方面的。然而，鸡的基因组编辑也引发了重要的伦理、监管和社会问题，这将塑造动物育种和农业的未来。
