《Frontiers in Immunology》：Enhancing the tumoricidal efficacy of the nanobubbles-mediated PD-L1 inhibition and immunogenic cell death in mice
编辑推荐：
本综述系统阐述了纳米气泡（NBs）共递送免疫原性细胞死亡（ICD）诱导剂Shikonin（SK）与免疫检查点抑制剂miR-497-5p，通过超声靶向纳米气泡破坏（UTND）技术，协同增强抗肝细胞癌（HCC）免疫应答的创新策略。研究证实该体系可有效诱导ICD（释放CRT、HMGB1等DAMPs）、激活CD80+CD86+巨噬细胞、下调PD-L1表达，并显著促进CD8+T细胞活化和细胞因子（如IFN-γ、IL-2）分泌，为肝癌免疫联合治疗提供了新思路。
背景
肝细胞癌（HCC）是全球范围内发病率和死亡率较高的恶性肿瘤，治疗挑战巨大。免疫治疗，特别是针对程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）及其配体（PD-L1）的免疫检查点阻断疗法，已成为癌症治疗的新范式。然而，肿瘤的低免疫原性和免疫抑制微环境限制了其疗效。免疫原性细胞死亡（ICD）是一种能够激活抗肿瘤免疫的细胞死亡方式，其诱导剂如从中药紫草中提取的Shikonin（SK），能够触发损伤相关分子模式（DAMPs）如钙网蛋白（CRT）和高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的释放。同时，微小RNA（miRNA），如miR-497-5p，被证实可靶向抑制肿瘤细胞中PD-L1的表达。本研究旨在开发一种纳米气泡（NBs）递送系统，用于共同递送SK和miR-497-5p，并利用超声靶向纳米气泡破坏（UTND）技术增强其靶向性和治疗效果，以期协同增强抗HCC的免疫反应。
方法
研究采用薄膜水化法和机械振荡法制备了负载miR-497和SK的阳离子纳米气泡（miR-497/SK-NBs）。通过扫描电子显微镜（SEM）、动态光散射（DLS）等技术对NBs的形态、粒径、Zeta电位、基因负载能力及SK包封率进行了表征。利用H22肝癌细胞构建了小鼠皮下移植瘤模型，用于评估体内抗肿瘤效果。动物实验经三峡大学医学动物护理与福利委员会批准（伦理批准号：2022050）。荷瘤小鼠被随机分为对照组、空白NBs组、游离SK组、miR-497-NBs组、SK-NBs组和miR-497/SK-NBs组，通过尾静脉注射给药并结合超声照射（参数：功率密度1 W/cm2，频率1 MHz，占空比50%，持续时间120秒）进行治疗。通过监测肿瘤体积、体重变化、肝功能指标（ALT、AST、ALP）以及重要器官的苏木精-伊红（H&E）染色来评估治疗效果和生物安全性。采用TUNEL法、免疫组织化学（检测Bax、Bcl-2）、免疫荧光（检测PD-L1、CRT、CD8a、IFN-γ、CD80、CD86）、流式细胞术（检测细胞凋亡、PD-L1表达、CRT表达、淋巴细胞增殖、NK细胞和巨噬细胞比例）、酶联免疫吸附试验（ELISA，检测HMGB1、ATP）以及逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR，检测Bax、Bcl-2、TNF-α、IFN-γ、PD-L1、CD8、CD80、CD86、IL-2、TGF-β等mRNA水平）等多种技术手段，深入探究了该联合疗法的抗肿瘤机制，包括诱导细胞凋亡、ICD效应、巨噬细胞活化、PD-L1下调以及T细胞介导的免疫应答。
结果
生物信息学分析显示，与癌旁组织相比，HCC组织中hsa-miR-497-5p表达显著下调。TargetScan预测及荧光素酶报告基因实验证实miR-497-5p可直接靶向结合PD-L1（CD274）基因的3'非翻译区（3'UTR）并抑制其表达。流式细胞术结果进一步表明，转染miR-497 mimic可显著降低Hepa1-6细胞表面PD-L1的表达。成功制备的miR-497/SK-NBs呈类球形，粒径约为358 ± 55 nm，Zeta电位为正，具有良好的miRNA负载能力（最大为1 μg/25 μL）和SK包封率（约42.57%-47.68%）。MTT实验确定了SK对Hepa1-6细胞的半数抑制浓度（IC50）约为3 μg/mL。
在H22荷瘤小鼠模型中，miR-497/SK-NBs+US治疗组表现出最强的肿瘤生长抑制效果，其肿瘤体积和重量抑制率分别达到65.54%和63.48%，显著优于其他各组。H&E染色显示该组肿瘤组织出现明显的变性坏死，且重要器官（心、肝、脾、肺、肾）未观察到显著病理损伤，肝功能指标及体重亦无异常变化，表明该治疗体系具有良好的生物安全性。TUNEL染色和流式细胞术检测凋亡率显示，miR-497/SK-NBs+US组肿瘤细胞凋亡程度最高。免疫组化和RT-qPCR分析发现，该组肿瘤组织中促凋亡蛋白Bax的表达上调，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下调，提示其通过线粒体途径促进了肿瘤细胞凋亡。
在免疫机制方面，免疫荧光、流式细胞术和ELISA检测证实，含有SK的治疗组（尤其是miR-497/SK-NBs+US组）能显著诱导ICD，表现为肿瘤细胞表面CRT暴露以及HMGB1和ATP的释放增加。同时，该组肿瘤组织和脾脏中CD80+CD86+巨噬细胞的活化比例显著升高。此外，miR-497/SK-NBs+US治疗有效下调了肿瘤组织中的PD-L1蛋白和mRNA水平。与此相呼应，流式细胞术显示该组脾淋巴细胞增殖能力最强；免疫荧光和RT-qPCR分析表明，肿瘤微环境中CD8+T细胞浸润增多，其效应分子IFN-γ以及免疫刺激因子IL-2的表达水平显著上调，而免疫抑制因子TGF-β的表达则下降。这些结果共同说明，miR-497/SK-NBs联合超声治疗能够通过诱导ICD和抑制PD-1/PD-L1通路，有效激活并增强机体抗肿瘤免疫应答。
讨论
本研究利用UTND技术，成功构建了共载SK和miR-497-5p的纳米气泡递送系统。该体系不仅实现了药物的靶向递送和控释，还通过超声的空化效应增强了细胞对药物的摄取。研究结果表明，miR-497/SK-NBs通过双重机制发挥协同抗肿瘤作用：一方面，SK诱导的ICD增加了肿瘤细胞的免疫原性，通过释放DAMPs激活抗原呈递细胞（如巨噬细胞），促进肿瘤抗原的呈递和T细胞的活化；另一方面，miR-497-5p介导的PD-L1下调阻断了免疫检查点通路，解除了对T细胞的抑制，从而放大了ICD引发的免疫反应。这种协同作用最终导致了强烈的系统性抗肿瘤免疫应答，有效抑制了肿瘤生长。该策略为克服HCC免疫抑制微环境、提高免疫治疗疗效提供了新的思路和方法。当然，该研究目前仍处于临床前阶段，其向临床转化面临诸如纳米载体的体内长期安全性、大规模生产的工艺稳定性以及个体差异等挑战，未来需要更深入的研究来推进。
结论
综上所述，本研究开发的miR-497/SK-NBs多功能纳米体系能够协同诱导免疫原性细胞死亡并阻断PD-1/PD-L1通路，在肝癌模型中展现出显著的抗肿瘤效果和免疫激活作用。该联合策略成功地将肿瘤从低免疫原性状态转变为免疫激活状态，并引发了强效且持久的系统性免疫反应，为对现有免疫检查点抑制剂应答不佳的实体瘤治疗提供了极具潜力的新方案。
