《Frontiers in Genetics》：Retrospective analysis of non-invasive prenatal testing: a population study involving 19,835 participants in the Shaoyang area
引言
胎儿染色体异常（包括非整倍体、拷贝数变异（CNVs）和嵌合体）是出生缺陷的主要原因之一。这些异常干扰胚胎发育的关键通路，导致复杂的临床表型，如多器官系统畸形、认知功能缺陷、性腺发育异常和躯体生长障碍，甚至危及生命。这些疾病通常具有不可逆性且缺乏有效治疗手段，给家庭生活质量和公共卫生资源带来沉重负担。因此，提升产前筛查技术和诊断策略对于阻断染色体异常胎儿出生、提高人口素质至关重要。
无创产前检测（NIPT）作为一种创新筛查技术，通过分析母体外周血中的胎儿游离DNA，利用高通量测序技术检测染色体非整倍体，具有无创、安全、准确性高等优点，已成为临床筛查常见胎儿染色体非整倍体（如T13、T18、T21）的重要方法。然而，该技术可能受到母体血浆中胎儿分数低、胎盘嵌合体、母体染色体变异等因素影响，存在一定假阳性风险。因此，NIPT筛查出的高风险孕妇需通过侵入性产前诊断程序（如羊膜穿刺术核型分析）进行确诊，羊膜穿刺术核型分析是诊断染色体异常的金标准。细胞遗传学与分子遗传学技术的联合应用可精确识别胎儿染色体数目和结构异常，为预防出生缺陷提供科学依据。本研究分析了19,835例NIPT案例及其对应诊断结果，旨在评估BGI平台的检测性能，并探讨父母年龄与子代染色体异常风险的相关性，可能为评估和预防染色体异常风险因素提供新视角。
材料与方法
研究对象
本研究于2019年10月1日至2024年4月30日期间，招募了19,835名来自邵阳地区、自愿接受NIPT并符合入选标准的孕妇。所有参与者均充分了解产前筛查/诊断的必要性和风险，并签署书面知情同意书。研究方案经邵阳市妇幼保健院伦理委员会批准（SYMCHH-EC-2024-001）。
BGI测序方法
采集孕妇外周血样本（5 mL）于EDTA抗凝管中，4°C保存，8小时内进行双次离心。使用深圳华大基因科技有限公司生产的DNA提取试剂盒从血浆中提取胎儿游离DNA。提取的DNA使用华大生物科技（武汉）有限公司提供的检测试剂盒进行文库构建，以检测胎儿染色体异常。构建的文库在深圳华大智造科技股份有限公司开发的BGISEQ-500平台上进行高通量测序。原始数据与人类基因组参考序列（GRCh37/hg19）进行比对，并采用Z检验评估测试样本与正常对照之间是否存在显著差异，从而判断染色体异常风险。
侵入性产前诊断
NIPT结果为高风险的孕妇接受遗传咨询并被转诊进行侵入性产前诊断。在超声引导下进行羊膜穿刺术，收集20 mL羊水用于核型分析和染色体微阵列分析（CMA）。
CMA分析
使用德国QIAGEN生产的提取试剂盒提取基因组DNA。羊水样本使用专注于产前应用的CytoScan 750K芯片（550,000个CNV探针 + 200,000个SNP探针）进行分析；所有原始数据均使用Affymetrix Chromosome Analysis Suite Software进行分析。为评估CNVs的致病性，参考了多个权威数据库，如Decipher、UCSC Genome Browser、OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man）、ISCA（International Standards for Cytogenomic Arrays）和DGV（Database of Genomic Variants）以及相关文献。
统计分析
本研究旨在分析2019年10月1日至2024年4月30日期间进行的NIPT检测数量以及高风险病例数，并评估数据集中的真阳性、假阳性、真阴性和假阴性实例。
计算了以下关键指标：
检出率 = 真阳性数 / 总检测数 × 100%
阳性率 = 高风险病例数 / 总检测数 × 100%
阳性预测值（PPV）= 真阳性数 / （真阳性数 + 假阳性数） × 100%
灵敏度 = 真阳性数 / （真阳性数 + 假阴性数） × 100%
特异性 = 真阴性数 / （真阴性数 + 假阳性数） × 100%
所有统计分析和可视化均使用R软件（版本4.5.1）进行。计算了95%置信区间（CI）。采用卡方检验和t检验评估统计学显著性，P值<0.05认为有统计学意义。
结果
NIPT阳性结果
共进行了19,835例NIPT检测，其中236例为阳性。最常见的三体是T13、T18和T21，共103例（43.10%）：其中T21有66例，T18有21例，T13有16例。此外，鉴定出13种罕见常染色体三体（RATs），共30例阳性（12.55%）。性染色体非整倍体占63例（26.36%），包括45,X 37例、47,XXY 14例、47,XYY 9例和47,XXX 3例。对于CNVs，NIPT检测到43例阳性（17.99%），包括12例常染色体微缺失、9例常染色体微重复、16例X染色体微缺失和6例X染色体微重复。
产前诊断结果
本研究共发现236例NIPT阳性结果。其中35例失访，201例接受了产前诊断，确认88例为真阳性。检测到的异常包括：T21 53例、T18 8例、T13 2例、45,X 2例、47,XXX 1例、47,XXY 7例、47,XYY 4例和CNVs 4例。值得注意的是，有1例涉及性染色体CNV（SC-CNV）。此外，检测到7例嵌合体：T15嵌合体（T15-M）、T21嵌合体（T21-M）和T22嵌合体（T22-M）各1例，以及3例性染色体嵌合体（SC-M）。另有1例CNV嵌合体（CNV-M）。
性能分析
对所有确诊病例的诊断结果进行统计分析，计算了常染色体和性染色体异常的PPV、灵敏度和特异性。结果表明，常见三体（T13/T18/T21）的总体PPV为75.29%，其中T21的PPV最高（91.53%），而T13的PPV最低（14.29%）。其他常染色体异常（OAAs）的总体PPV为14.63%。RATs的PPV为9.09%，而常染色体CNVs的PPV为20.00%。所有常染色体异常的合并PPV为55.55%。共诊断出18例性染色体异常（SCAs），总体PPV为21.95%。其中，性染色体非整倍体的PPV为24.56%。47,XXX和47,XXY的PPV最高，均为50%，47,XYY的PPV为40.00%。相反，45,X（6.67%）和SC-CNVs（4.55%）的PPV最低。
父母年龄与染色体异常的关系
对父母年龄进行分层，分析年龄与染色体异常PPV的关系。当母亲年龄<35岁时，常染色体异常（AAs）的PPV为54.67%，而SCAs的PPV为27.78%。相比之下，当母亲年龄≥35岁时，常染色体异常的PPV为56.00%，而SCAs的PPV降至12.50%。当父亲年龄<35岁时，常染色体异常和SCAs的PPV分别为46.55%和25.49%。相反，当父亲年龄≥35岁时，这些值分别升至63.24%和降至18.52%。综合分析父母年龄，当父母双方均<35岁时，其各自的PPV分别为47.27%和26.53%。相比之下，如果父母年龄≥35岁，这些PPV转变为57.45%和13.64%。可以得出结论，当父亲年龄≥35岁时，常染色体异常的PPV超过父亲<35岁的群体；然而，对于SCAs，这一趋势相反，年轻父亲的PPV更高。同样，夫妻双方均低于35岁时，表现出较低的常染色体异常PPV和较高的SCA PPV。
对201份诊断样本中父母年龄的分布进行分析发现，当父母双方年龄均≥35岁时，共有69份样本，其中30份检测为阳性，占该年龄组的43.48%。在阳性病例中，鉴定出19例T21、5例T18、1例T15-M、2例CNV、1例47,XYY和2例SC-M。当父亲年龄≥35岁且母亲年龄<35岁时，观察到25份样本；其中18份为阳性结果，比例为72%，包括13例T21，以及T18、T13、CNV、47,XYY和SC-M各1例。相反，当父亲年龄<35岁且母亲年龄≥35岁时，仅鉴定出5份样本，只有1例确诊（T21），比例为20.00%。此外，当父母双方均<35岁时，有102份样本。确诊39例，比例为38.24%，包括21例T21，2例T18、45,X和47,XYY，以及T13、T21-M、T22-M、47,XXX和SC-CNV各1例。最后，所有7例47,XXY均集中在父母双方均<35岁的群体中。
对不同年龄层真阳性率进行统计分析。在夫妻双方均≥35岁的群体中，常染色体异常和SCAs的检出率分别为5.49‰和0.61‰。相反，在夫妻双方均<35岁的群体中，检出率分别为2.62‰和1.31‰。
讨论
NIPT技术在检测孕妇T13、T18和T21等非整倍体方面的临床应用已广泛建立。此外，检测范围正逐渐扩展到其他染色体异常，如SCAs和CNVs。本研究对19,835例NIPT样本进行回顾性分析，以评估BGI平台的性能。T21、T18和T13的PPV分别为91.53%、61.54%和14.29%。值得注意的是，T21和T18的PPV高于Lu等人报道的结果，而T13的PPV低于其发现。此外，Xu L等人报道了基于Illumina平台的Berry Genomics检测试剂盒的性能，其T21和T18的PPV（82.52%和60.71%）低于我们的结果，而T13的结果（25.00%）高于我们。
Basecare公司基于Proton平台的试剂盒性能显示，只有T21的PPV（84.07%）比我们的结果低7.46%，而T18和T13的PPV均高于我们，尤其是T13的PPV高达46.67%。这种差异可能归因于他们使用基于磁珠的胎儿DNA富集方法。
本研究中报告的T13、T18和T21复合PPV结果高于Lu等人报道的结果。因此，我们分析了四项研究的阳性率以及高龄产妇（≥35岁）样本的比例。发现本研究的NIPT阳性率高于Lu等人的研究；在Xu L和Xue Y的报告中也观察到类似情况。此外，本研究中高龄产妇参与者的比例为28.51%，显著高于Lu等人报道的仅8.35%。这种差异表明，较高比例的高龄产妇可能导致NIPT阳性率增加。这一发现与Liu等人的结论一致，即高龄产妇会增加胎儿染色体异常的风险。Lu等人研究中高龄产妇比例较低可归因于其数据来源于长沙市全民NIPT筛查项目。
目前，NIPT在中国尚未被广泛采用作为妊娠期染色体异常的一线筛查方法。通常，它主要提供给超声软指标异常、高龄产妇或通过血清筛查发现临界风险的患者。这些群体更可能选择NIPT。因此，本研究中高龄产妇的比例显著较高，这与Xu L（36.40%）和Xue Y（25.30%）的研究一致。
在性染色体非整倍体方面，本研究的总体PPV也低于表中三个平台报道的结果。其中，Basecare使用基于磁珠的DNA富集方法，显示出优于其他平台的技术性能。此外，尽管我们也使用BGI平台，但我们的性染色体非整倍体PPV低于Yangmei等人报道的结果。这种差异可能是由于他们的数据来源于长沙市的政府公益项目，孕妇依从性高。相比之下，我们观察到35例NIPT阳性样本失访，这可能导致了本研究中较低的PPV。
近年来，关于母亲年龄与染色体异常关系的讨论相当多。然而，父亲年龄在以往的研究中很大程度上被忽视。为了弥补这一空白，我们收集了父亲年龄数据。如表所示，当父母双方均≥35岁时，常染色体异常的检出率（5.49‰）显著高于父母双方均<35岁时（2.62‰）。其中，T18（1.02‰）和T21（3.86‰）的检出率在父母双方均≥35岁时相对较高。然而，两组中SCAs的检出率显示出相反的结果。我们发现父母双方均<35岁时SCAs的检出率（1.31‰）高于父母双方均≥35岁时（0.61‰）。图中结果显示，除SC-M外，SCAs主要集中在父母双方均<35岁的区域。这一发现表明，与高龄父母群体相比，年轻父母年龄与SCAs风险增加相关。Yiwei等人报道父亲年龄<20岁会增加子代染色体疾病的风险。然而，我们的队列缺乏父亲<20岁的样本，无法与Yiwei等人的发现直接比较。
如表所示，所有47,XXY病例（n = 7）均仅在夫妻<35岁时观察到，检出率为0.7‰。这一新发现表明，年轻父母年龄（双方均<35岁）可能是47,XXY的潜在风险因素。与此一致的是，我们对性染色体异常的分析显示，年轻父母年龄与较高的PPV相关。Kaltsas等人最近的一项研究提到了相同的结论，即47,XXY的存在与高龄父亲有关，这与我们的结论不一致。
高龄父亲（≥35岁）群体中常染色体异常的检出率显著高于父亲年龄<35岁的群体。这表明高龄父亲与T13、T18和T21风险增加显著相关。Jimbo等人报道高龄父亲与染色体非整倍体发生率增加有关，这与我们的发现一致。一些研究表明父亲年龄与染色体疾病风险无关。然而，Sánchez-Pavón等人进行的研究揭示，父亲年龄是T21的重要风险因素。父亲年龄是否是常染色体异常的风险因素尚无定论，需要进一步的研究和数据来澄清这种关联。我们的结果表明父亲年龄可能对T21的发生率（2.80‰ VS 2.01‰）有影响，但需要收集更多数据来验证这一结论。
值得注意的是，所有三例SC-M均与高龄父亲有关。Reich等人发现SC-M的发生率与母亲年龄显著相关，但未涉及父亲年龄的潜在影响。鉴于SC-M发生率低且缺乏先前将嵌合体与父母年龄联系起来的研究，我们假设存在潜在关联，需要通过更大的队列进行验证。
在中国，夫妻之间的年龄差异通常很小。如图所示，对夫妻年龄的线性回归分析显示出强烈的正相关性（R2 = 0.77）。这表明高龄母亲与高龄父亲密切相关。因此，在分析父母年龄与染色体异常发生率的关系时，必须同时考虑母亲和父亲的年龄。先前报道的母亲年龄对染色体异常的影响可能是父母双方年龄共同作用的结果。
总之，我们对实验室5年NIPT数据进行了全面分析，评估了BGI平台的性能，并探讨了父母年龄与子代染色体异常的相关性。我们的研究结果证明父母年龄与染色体异常的发生率存在显著关联。具体而言，高龄父母可能增加常染色体异常风险，而年轻父母可能升高性染色体异常风险。这些结果为预防染色体异常的临床策略提供了新的见解。我们研究结果的普适性可能受到样本量的限制，并且我们没有系统收集参与父母的近亲状况数据。因此，未来的研究应旨在收集更多数据，以加强我们结论的证据基础。
