《Genome》：Technological advances in trait development: from conventional breeding and untargeted mutagenesis to precision genome editing
摘要
植物生物技术通过实现精准高效的作物改良策略，彻底改变了现代农业。本综述探讨了选择育种、突变育种和精准育种的演变历程，重点介绍了它们在加拿大农业领域的应用。常规选择育种在开发高产、抗病栽培品种方面发挥了重要作用，而通过物理和化学诱变进行的突变育种则引入了宝贵的遗传多样性。转基因育种的出现允许直接插入外源基因，从而开发出具有耐除草剂、抗虫害和改善营养成分的作物。然而，对监管限制和公众接受度的担忧推动了基因组编辑工具的快速采用，这些工具能够在不引入外源DNA的情况下进行精确修饰。加拿大在应用这些生物技术创新方面发挥了关键作用，成功开发了转基因油菜、CRISPR编辑的小麦、抗逆大豆以及改良了抗逆性和产量的燕麦和大麦栽培品种。虽然每种育种方法都有其独特的优势和局限性，但整合常规和分子技术对于最大化遗传潜力、确保农业发展和有效应对粮食安全挑战至关重要。
引言
作物性状改良一直是农业的基本方面，塑造了人类种植和利用植物获取食物、纤维和各种应用的方式。历史上，早期农民进行初步选择，选择具有理想性状的植物，如更大的籽粒、改良的口味和更强的环境胁迫抗性。这种早期的选择形式为后来成为植物育种科学奠定了基础。随着时间的推移，美索不达米亚、埃及和中国的文明发展了早期的育种技术，包括异花授粉和种子保存，以提高作物性能。
19世纪格雷戈尔·孟德尔遗传原理的发现为植物育种提供了科学基础，使研究人员能够理解性状如何从一代传给下一代。这一知识通过允许育种者系统地操纵遗传性状，彻底改变了作物改良。在整个20世纪，杂交育种、诱导突变和分子标记等进步促进了高产、抗病和气候适应性作物的开发。20世纪中期的绿色革命技术通过引入高产的小麦和水稻栽培品种，并辅以现代灌溉和施肥实践，进一步加速了农业生产力的提高。
随着20世纪末和21世纪初生物技术的出现，植物育种进入了一个精准的新时代。基因工程允许在不同物种之间直接转移理想基因，导致具有除草剂抗性和昆虫耐受性等性状的转基因（GM）作物的商业化。最近，像成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关蛋白（Cas）这样的基因组编辑技术，通过能够在DNA水平上进行靶向修饰而不引入外源基因，进一步优化了作物改良策略。
本综述旨在探讨通过三种关键方法学进行的作物性状发展进程：选择育种、突变育种和精准育种。通过考察它们在加拿大背景下的原理、方法和成功案例，本文旨在提供关于植物生物技术如何继续塑造现代农业的全面分析。讨论将重点介绍加拿大对这些进步的贡献，展示小麦、油菜、燕麦和大豆等主要作物的显著改进。最终，本综述旨在强调不断发展的育种技术在确保加拿大粮食安全、增强作物韧性和促进可持续农业实践方面的影响。
选择（常规）育种
选择育种，也称为人工选择，是一个有意选择具有理想性状的植物进行繁殖，以产生具有增强特性的后代的过程。与自然选择不同，选择育种是一个人为驱动的过程，旨在改善作物性状，如产量、抗病性、耐旱性和营养成分。这种技术几个世纪以来一直是农业的基础，并且继续是现代作物改良的基石。
选择育种在塑造加拿大农业景观方面发挥了根本作用。加拿大早期的育种工作主要侧重于使作物适应该国多样化的气候条件，确保更高的产量并增强对疾病的抗性。加拿大最早的重要育种计划建立于19世纪末和20世纪初，重点集中在谷物作物上，如小麦和大麦。
加拿大植物育种最早的成功案例之一是1904年由查尔斯·桑德斯爵士开发的侯爵小麦。这个栽培品种将红菲特小麦的早熟性与硬红加尔各答小麦的高谷物品质相结合，使其非常适合加拿大短暂的生长季节。侯爵小麦显著提高了小麦产量，并为该国现代小麦育种计划奠定了基础。
多年来，加拿大的植物育种工作扩展到包括油籽、豆类和饲料作物，这是由对更高生产力和气候适应性的需求驱动的。20世纪70年代加拿大研究人员开发的油菜是一项里程碑式的成就，改变了油籽产业。选择育种的进步，包括分子标记和基因组选择的使用，进一步加速了作物改良工作，使加拿大成为作物性状发展的先驱。
成功案例在加拿大
加拿大通过选择育种为农业创新做出了重大贡献，增强了作物的可持续性和经济增长。加拿大农业最早的成功故事之一是小麦育种，其历史可以追溯到1842年红菲特小麦的引入，这是一个非常适合加拿大挑战性气候的栽培品种。这一发展为现代小麦育种工作奠定了基础，最终在1904年发布了侯爵小麦栽培品种。侯爵小麦通过提供早熟和高质量谷物，彻底改变了加拿大小麦生产，为持续改进树立了先例。如今，加拿大科学家仍然处于小麦育种的前沿，开发优化产量、提高品质并具有强大抗病性的新栽培品种。
加拿大在选择育种方面的另一个显著成就是油菜，这是在20世纪60年代和70年代通过对油菜籽的广泛研究开发出来的。加拿大研究人员成功消除了不良化合物，如芥酸和硫代葡萄糖苷，创造了一种食品级油籽，不仅取代了传统的油菜籽，而且成为该国最有价值的作物之一。油菜生产现在遍布加拿大数百万英亩的土地，为农业经济和全球植物油市场做出了实质性贡献。
同样，曾经在加拿大是次要作物的大豆，由于耐寒栽培品种的进步而经历了指数级增长。在20世纪70年代，加拿大研究人员引入了如OAC Eclipse这样的栽培品种，其特点是生长季节较短，使大豆生产能够扩展到安大略省西南部以外。如今，大豆作为玉米生产者的关键轮作作物，是加拿大主要的食用油来源，展示了选择育种在使国家农业景观多样化方面的变革力量。
大麦育种也取得了显著进展，特别是在改善麦芽品质和抗病性方面。如CDC Copeland和AC Synergy等高性能栽培品种的开发确保了加拿大大麦符合酿造行业的严格标准，同时保持了强大的农艺特性。这巩固了加拿大作为国内和国际市场高质量麦芽大麦领先生产商的声誉。
同时，燕麦育种成功地复兴了表现出卓越适应性和营养效益的旧栽培品种。传统燕麦栽培品种，如AC Mustang，由于其韧性和市场生存能力而重新获得重视，证明选择育种可以在提高其性能的同时维持旧遗传系的价值。如CDC Dancer等高质量燕麦栽培品种的引入通过提供改进的抗锈病性和优越的营养成分，进一步推动了该行业的发展，帮助加拿大燕麦在全球市场中获得吸引力。
这些育种成就共同凸显了加拿大对农业创新的承诺，确保其农业产业在不断变化的全球格局中保持竞争力、韧性和可持续性。
突变育种
自从20世纪30年代第一个烟草突变栽培品种发布以来，使用物理、化学、生物或转基因技术进行诱变诱导已成为植物育种和功能基因组学的重要工具。联合国粮农组织/国际原子能机构-突变栽培品种数据库报告称，在70多个国家的225种植物物种中，已有超过3275个突变栽培品种正式发布供商业使用。从基础科学的角度来看，突变提供了一个工具，可以使用正向遗传学或反向遗传学来研究基因功能，并创造遗传变异。从应用的角度来看，突变育种利用植物自身的遗传构成，模拟自然自发突变过程，以增加多样性并引入新的潜在有用的表型。
突变育种涉及突变诱导、检测和验证。尽管突变诱导具有成本效益、快速、成熟和稳健的特点，但主要挑战是检测新诱导的突变。突变发生的频率非常低；因此，需要创建非常大的突变群体（数千个个体植物）才能实现有用突变的检测。此外，当突变处于杂合状态时，可能不会引起任何可检测的表型变化，这使得传统的筛选方法效率低下，并且可能遗漏许多有价值的突变体。
尽管有其优势，突变育种在可扩展性和精确性方面面临挑战。使用传统技术生产、处理和分析大型突变群体需要大量的努力和资源。尽管高通量基因分型和基因组测序的进步改善了突变的检测，但对大群体进行全基因组测序对许多作物来说仍然成本高昂。研究人员通常依赖表型筛选，这可能耗时且在识别有益突变方面效率较低。然而，当与现代分子工具结合时，突变育种仍然是作物改良的有力方法。
成功案例在加拿大
在加拿大，突变育种导致了具有增强农艺性状的改良小麦栽培品种的开发，包括除草剂抗性以及对镰刀菌头疫病和锈病的改良抗性。例如，Pozniak和Hucl（2004）对小麦栽培品种CDC Teal使用EMS诱变，诱导出赋予对咪唑啉酮类除草剂抗性的基因，为加拿大春小麦提供了一种替代杂草控制系统。此外，由S. Kagale博士领导的研究人员，在加拿大基因组研究与开发计划下，使用伽马辐射开发了一个基于CDC Stanley的缺失了Ph1位点的小麦品系。该缺失消除了与野生近缘种杂交的遗传障碍，增强了加拿大条件下的育种潜力，并提高了在多变气候下的产量稳定性。
类似地，化学和物理诱变，例如使用EMS，在开发具有提高含油量和降低不良化合物水平的油菜栽培品种方面发挥了关键作用，使它们更能适应环境胁迫和害虫。
突变育种也推动了加拿大大麦和扁豆生产的发展。圭尔夫大学的Lukens和Navabi教授应用EMS诱变，开发了具有增强耐旱性和早熟性的大麦栽培品种，使其能够在多样化的环境中种植。同样，扁豆中的突变育种通过化学诱变诱导AHAS基因的点突变，引入了除草剂耐受性，并通过常规育种整合。
这些成功突显了突变育种在加强加拿大农业方面的重要作用。诱变与先进基因组工具（例如MutMap）的整合将继续优化育种计划，确保加拿大作物在全球市场中保持竞争力。随着研究人员改进突变检测技术并开发用于全基因组筛选的成本效益策略，突变育种有望为作物改良和可持续农业实践做出进一步贡献。
精准育种：转基因和基因组编辑
植物育种中生物技术方法的出现代表了农业的范式转变，使科学家能够以前所未有的精确度操纵植物基因组。传统的育种方法，如选择育种和杂交，历史上在开发改良作物栽培品种方面发挥了重要作用，但它们存在局限性，包括育种周期长以及无法引入无关物种的性状。随着分子生物学和基因工程的进步，现代育种技术，如转基因和基因组编辑，彻底改变了具有增强性状作物的开发。
生物技术植物育种的旅程始于DNA作为遗传物质的发现以及重组DNA技术的发展，这使得在不同生物体之间转移基因成为可能，从而产生了第一批转基因植物。农杆菌介导的转化的早期突破允许科学家将外源DNA引入植物基因组，从而在20世纪80年代产生了第一批转基因作物。到了20世纪90年代， commercially available GM crops such as herbicide-tolerant soybeans and insect-resistant maize had entered the global market, changing agricultural landscapes worldwide.
转基因，或转基因育种，是指将来自无关生物体的外源基因（转基因）插入植物基因组以赋予新性状的过程。这种技术已被广泛应用于开发抗害虫、除草剂、疾病和环境胁迫的作物。一个突出的例子是Bt作物，它含有来自苏云金芽孢杆菌的基因，能产生杀虫蛋白，显著减少了农药使用。另一个例子是黄金大米，经过工程化改造以生产维生素A，解决发展中国家的微量营养素缺乏问题。
尽管转基因育种取得了成功，但公众对转基因生物（GMO）的担忧和监管障碍导致了对遗传修饰替代技术的探索。基因组编辑，特别是CRISPR-Cas系统，已成为一种强大的工具，允许在植物现有DNA内进行精确修饰，而不引入外源基因。在CRISPR技术广泛采用之前，早期的基因组编辑方法如锌指核酸酶（ZFN）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）在21世纪初被开发出来。这些工具允许科学家对DNA进行位点特异性修饰，但成本高昂且技术复杂。2012年开发的CRISPR-Cas9通过提供更快、更便宜、更精确的植物基因编辑方法，彻底改变了基因组编辑。CRISPR能够实现靶向基因敲除、插入或修饰，从而获得如疾病抗性、耐旱性和提高产量潜力等性状。值得注意的是，基因组编辑作物在一些国家通常绕过GMO法规，因为它们不引入外源DNA。虽然强大，但作物中的基因编辑污染可能导致脱靶突变或生态干扰，例如基因流向非目标群体，可能影响生物多样性或作物性状。强大的安全协议可以有效管理这些风险，以确保可持续农业。
转基因或基因组编辑的过程涉及几个关键步骤：基因发现、基因修饰、转化、再生以及筛选与验证。测序技术的进步极大地促进了基因发现和筛选，使得能够精确识别用于作物改良的靶基因。同时，基因组修饰正随着CRISPR变体（如碱基编辑和先导编辑）的创新而接近完美，允许更精确和高效的编辑。然而，转化和再生仍然是重大挑战，因为许多植物物种仍然难以进行遗传修饰。
植物转化
植物转化技术的进步显著提高了遗传修饰的效率和精确度。稳定转化对于开发具有可遗传性状的转基因作物至关重要，而瞬时转化广泛用于研究中的快速功能分析。
将外源DNA转移到植物细胞中仍然是一个挑战，但由于保护性的细胞壁，但几种递送方法如基因枪法和农杆菌介导的转化已被开发出来。农杆菌介导的转化是最广泛使用的技术，因为其效率高且能够产生单拷贝插入，对基因组干扰最小。这个过程依赖于位于辅助质粒上的毒力（vir）基因，这些基因促进转移DNA（T-DNA）转移到植物基因组中。T-DNA，两侧为左边界（LB）和右边界（RB），被随机整合到植物基因组中。
为了优化植物转化，研究人员修改了农杆菌载体。传统的双元载体系统将T-DNA与毒力基因分开，允许在整合到植物基因组之前更容易地操作和克隆转基因。这些载体经过进一步改进，以实现在大肠杆菌中的更高拷贝数、增加与不同农杆菌菌株的兼容性以及提高转化效率。然而，挑战依然存在，包括多个T-DNA整合、骨架载体掺入和转基因沉默。多次插入可能使遗传模式复杂化，干扰内源基因，并通过植物RNA干扰（RNAi）途径增加基因沉默的可能性。
为了解决这些问题，开发了低拷贝双元载体以提高整合保真度并最小化骨架载体掺入。进一步的进展包括农杆菌中的染色体T-DNA发射点，这促进了单位点插入。最近，设计了双元细菌人工染色体载体和转化感受态人工染色体载体，以转移大的DNA构建体（高达150 kb），同时保持低拷贝数，确保在农杆菌和大肠杆菌中的转基因稳定性。构建大的转基因仍然具有技术挑战性，因为克隆位点有限且大质粒连接效率低。几种先进的克隆系统，包括Gateway、IIS型限制性内切酶位点、Gibson Assembly和ZFN，已被用于高效的转基因组装。此外，体内基因组装已成为一种有前途的替代方案，利用酵母中的同源重组或大肠杆菌中的Cre/LoxP重组酶技术。GAANTRY系统利用整合酶/重组酶方法，允许在 disarm 的毒力质粒内直接组装大的T-DNA构建体，解决了传统双元载体遇到的稳定性问题。
尽管有这些进步，许多作物物种仍然难以转化。主要挑战是从转化组织中再生可育植物，这个过程依赖于生长素/细胞分裂素比率进行体细胞器官发生或胚胎发生。虽然一些物种能有效再生，但其他物种需要额外的遗传调节因子。形态发生因子如Babyboom（BBM）、WUSCHEL（WUS）和生长调节因子4（GRF4）及其辅因子GRF相互作用因子1（GIF1）已被成功用于提高再生率，特别是在难以转化的物种中。
为了确保稳定的转基因整合，使用了选择标记基因。如nptII（新霉素磷酸转移酶II）等抗性盒提供了对卡那霉素的中等选择压力，而hpt（潮霉素磷酸转移酶）则用潮霉素提供更严格的选择。此外，报告基因有助于识别转化组织。RUBY盒产生红色甜菜红素用于非破坏性筛选，而β-葡萄糖醛酸酶（GUS）和荧光蛋白（GFP、RFP）提供成功转化的视觉确认。除了传统的体外再生，体内稳定转化策略正在成为有效的替代方案。这些方法消除了对广泛组织培养的需求，减少了与产生转基因植物相关的时间和复杂性。
基因组精确修饰
转基因随机整合到植物基因组中对转基因表达和稳定性提出了挑战。为了确保稳定和可预测的转基因表达，开发了位点特异性整合策略。一种方法，迭代位点特异性整合系统（ISSI），使用Cre重组酶和?C31整合酶成功实施。该方法能够在预先引入的attP重组位点进行转基因叠加，同时移除选择标记。然而，attP位点的初始放置仍然依赖于随机T-DNA整合，需要在进一步修饰之前筛选最佳插入位点。
精确基因组修饰的一个重大突破是CRISPR/Cas系统。CRISPR在精确度、效率和成本效益方面超越了以前的基因组编辑工具。源自II型细菌适应性免疫系统，CRISPR通过将外源核酸片段作为感染遗传记忆整合到细菌基因组中而起作用。这些片段作为间隔区存储在CRISPR阵列中，在后续感染时被转录成CRISPR RNA（crRNA）。crRNA与Cas核酸酶复合物，识别并切割cDNA序列，使其成为强大的基因组编辑工具。
CRISPR/Cas9，最广泛使用的变体，利用化脓性链球菌的Cas9内切酶产生位点特异性DNA断裂。设计向导RNA（gRNA）——与靶基因互补的17-20个核苷酸序列——是第一步，用于将Cas9引导到基因组中的特定位点。原间隔区相邻基序（PAM）序列对于Cas9结合至关重要，在不同Cas9变体之间有所不同；例如，SpCas9识别5'-NGG-3'。一旦Cas9引入双链断裂（DSB），植物细胞通过两种途径之一修复损伤：非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）。NHEJ是一个容易出错的过程，通常导致小的插入或缺失（indel），从而导致基因敲除。相反，HDR通过使用同源修复模板能够精确插入所需序列。然而，HDR在植物中的效率显著低于NHEJ，限制了其用于精确基因插入的应用。
为了提高CRISPR效率，在gRNA表达和Cas蛋白优化方面进行了改进。gRNA通常在Pol III启动子下转录，而Cas9在强组成型启动子（如RPS5A）下表达，以确保在分生组织和种系细胞中的稳健活性。此外，带有核定位信号的密码子优化的Cas9变体提高了诱变效率。例如，内含子化的玉米Cas9（zCas9i）显著增加了突变频率，允许在T0代回收纯合突变。除了标准基因组编辑，基于CRISPR的工具已扩展到碱基编辑、先导编辑、转录调控、表观遗传修饰和RNA靶向。这些新的应用有望进一步增强作物改良策略，为开发高产、气候适应性和营养增强的植物栽培品种提供解决方案。
加拿大在性状发展的生物技术应用方面的成功故事
加拿大在应用生物技术方法增强作物性状方面一直是全球领导者，确保更高的产量、对生物和非生物胁迫的抗性以及改善的营养成分。在转基因和基因组编辑作物的开发和商业化方面取得了若干重大成功，特别是在小麦、油菜和大豆方面。
最显著的例子之一是转基因油菜，它是通过基因工程开发以提高除草剂抗性。自20世纪90年代引入以来，耐除草剂油菜栽培品种显著提高了作物效率并减少了杂草控制劳动力。如今，加拿大仍然是世界上顶级的油菜生产国之一，该国种植的几乎所有油菜都是转基因的。加拿大研究人员已成功使用CRISPR/Cas9编辑小麦基因组，以开发具有增强抗病性的栽培品种。类似地，基因组编辑已应用于大豆，以研究参与白霉病抗性的基因，并应用于燕麦，其中优化的方法改善了性状发展。
未来展望
生物技术进步继续改变植物育种，选择育种、突变育种和精准育种各自提供独特的优势和挑战。选择育种仍然是接受最广泛、监管最少的途径，提供作物性状的渐进式改进。然而，它通常需要长的育种周期，这可能会延迟理想特性的引入。突变育种加速了遗传变异，但涉及随机突变，需要大量筛选以识别有益性状。相比之下，包括转基因和基因组编辑在内的精准育种提供了最靶向的改进，以更少的意外遗传变化提供快速的性状增强。然而，监管挑战和公众认知仍然是广泛采用的障碍。
展望未来，这些方法的整合可能在可持续农业中发挥关键作用。合成生物学和表观遗传修饰的进步可能会进一步扩大精准育种的潜力，使得能够在不改动DNA序列的情况下微调基因表达。非GMO基因组编辑技术（如碱基编辑和先导编辑）的发展可能有助于规避监管障碍，提高工程化作物的接受度。
加拿大强大的研究基础设施使该国成为植物生物技术的领导者。对基因组编辑、转化技术和监管科学的持续投资将推动作物改良的进步，加强加拿大对全球粮食安全和可持续性的贡献。
