《Dalton Transactions》：Light- and copper-activated (photo)cytotoxicity of 8-hydroxyquinoline-based boron photosensitizers with lipid droplet targeting and lipid peroxidation accumulation
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本文报道了一系列新型8-羟基喹啉基四配位硼配合物（BQ1-BQ7）的设计合成与性能研究。重点揭示了BQ7作为无重金属光敏剂（PS）的独特优势：在聚集状态下表现出显著的光激活荧光发射和活性氧（ROS）生成能力，能够特异性靶向脂滴（LDs）并诱导脂质过氧化（LPO）积累，最终引发铁死亡（ferroptosis）样细胞死亡。该探针还具有Cu2+响应性荧光淬灭特性，其与铜形成的配合物能进一步增强细胞毒性。研究通过实验与理论计算（QM/MM）相结合，阐明了其光物理机制（如AI-ISC），为开发用于癌症治疗（PDT/化疗）的多功能探针提供了新的分子设计策略。
引言
光动力治疗（PDT）因其微创性和可控的细胞毒性，被认为是治疗包括癌症在内的多种疾病的一种有前景的方法。该过程涉及光敏剂（PSs）的施用，这些光敏剂被设计用于选择性递送并富集在肿瘤组织中。在特定光照射下，这些PSs产生活性氧（ROS），诱导恶性细胞死亡，同时保留周围的正常细胞。尽管有其潜力，但传统的PSs表现出几个局限性：在肿瘤内常见的聚集状态下，其荧光发射和ROS生成显著淬灭；不受控制的系间窜越（ISC）过程导致荧光辐射衰减可忽略不计，限制了其在生物环境中的应用；虽然通过引入重原子可以增强ISC过程，但这种修饰可能导致潜在的暗毒性；大多数PSs通过II型光反应发挥作用，该反应高度依赖于氧气浓度，这在实体瘤微环境特有的缺氧条件下构成了挑战；PSs常常遭受非特异性定位，降低了治疗效果；PSs有限的多功能性限制了其在协同光疗、化学传感和治疗诊断学等领域的更广泛应用。这些缺点需要持续的研究和开发，以提高PSs在临床环境中的功效和适用性。
此外，PDT触发一系列细胞反应，最终通过凋亡和/或坏死导致细胞死亡。然而，某些细胞适应性，如缺氧诱导的和多药耐药蛋白的上调，可使细胞对凋亡产生抵抗。这突出了开发对氧气依赖性最小且能够诱导非凋亡性细胞死亡途径的PSs的必要性。铁死亡（ferroptosis），一种不同于凋亡的细胞死亡形式，以铁依赖性和特定的形态变化为特征，包括线粒体异常和缺乏核反应，最近作为癌症治疗的一种有前景的策略而受到关注，因为它对抵抗凋亡的癌细胞有效。如文献报道，PSs产生的ROS导致谷胱甘肽（GSH）的快速消耗，随后抑制谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）活性。这种抑制导致脂质过氧化物（LPOs）的积累，从而触发铁死亡。
在一项相关研究中，S. Tardito等人证明8-羟基喹啉诱导人肿瘤细胞活力的剂量依赖性降低。然而，当铜共同给药时，配体的作用被显著放大，导致在所研究的细胞系中产生显著的细胞死亡。基于8-羟基喹啉的Cu(II)复合物的细胞毒性浓度导致细胞内铜积累增加和内质网的广泛空泡化，先于一种非凋亡性（副凋亡）的细胞死亡形式。此外，重金属离子如Cu2+的检测已成为生物分析和环境监测的关键焦点，因为它们在生理和病理过程中具有重要作用。荧光探针因其高选择性、灵敏度、操作简单、快速响应和低成本等优点，已成为检测Cu2+离子的非常有效的工具。值得注意的是，据我们所知，尚未有研究探索使用含有单阴离子双齿（N^O）配体的硼配合物作为检测Cu2+的荧光探针。
因此，我们合成了一系列基于8-羟基喹啉的硼四齿配合物（BQ1–BQ7）。这些配合物的光物理性质在各种状态下得到了彻底检查，并得到了包括密度泛函理论（DFT）计算和混合QM/MM模拟在内的计算研究的支持。值得注意的是，BQ7显示出作为用于I型PDT的无重金属PS的巨大潜力，在肿瘤样条件下（如聚集状态和缺氧环境）表现出高荧光发射。BQ7被证明可诱导脂滴特异性过氧化，在PDT过程中导致铁死亡样细胞死亡。此外，BQ7作为一种新型的Cu2+激活探针，由于形成基于8-羟基喹啉的Cu(II)配合物而增强了光/暗细胞毒性。这种设计为光治疗应用提供了一种新型的I型PS。
合成与结构表征
BQ1–BQ7是通过BPh3和8-羟基喹啉衍生物在环境温度下，在氯仿溶剂中以1:1的摩尔比进行简单反应合成的。BQ1–BQ7的结构通过NMR、HR-MS、IR光谱和元素分析（MAD = 0.09–0.23%）得到确认，详细信息见SI。为了进一步探索配合物的结构，通过单晶X射线衍射（SC-XRD）研究了三个代表性配合物，包括BQ2、BQ6和BQ7。BQ2、BQ6和BQ7的分子结构证实，这些配合物中的硼中心表现出典型的四面体配位，与两个苯基的碳原子以及喹啉醇盐配体的N和O原子配位。此外，从BQ7的SC-XRD结构计算的粉末XRD图谱与相应的实验图谱高度一致。相比之下，在BQ2和BQ6的计算和实验粉末XRD图谱之间观察到的差异是显著的而非微小的。这些差异表明存在多个晶相：一个与单晶分析确定的结构一致，另一个相负责实验数据中观察到的明显更强烈的衍射峰。
光物理特性
在不同溶剂（即从非极性（如甲苯（Tol））到极性非质子（如四氢呋喃（THF）和乙腈（ACN））中，对浓度为10 μM的BQ1–BQ7化合物的稳态吸收和发射光谱进行了研究。值得注意的是，在这些溶剂中，386至421 nm之间的紫外-可见吸收带峰表明存在硼螯合的8-羟基喹啉部分。所有化合物的吸收带都是无结构的。此外，这些化合物随着溶剂极性的增加，吸收表现出适中的蓝移，而发射峰不变。未取代的BQ1化合物在Tol、THF和ACN中显示出最大吸收带范围从386到400 nm，在约502 nm处有一个显著的发射带最大峰（荧光量子产率，FL QY (ΦF) = 0.41–0.62）。与相应的吸收光谱类似，发射带是无结构的。一系列卤素取代的化合物（BQ2–BQ6）显示出相似的特征，并且与BQ1相比，其吸收和发射光谱有明显的红移。它们显示出约5000 cm?1的相似斯托克斯位移，这比BODIPY或花青染料观察到的值大得多，表明激发后键长或键角发生显著变化。BQ2–BQ6与BQ1相比的光谱红移可归因于卤素取代基的吸电子性质，主要导致最低未占分子轨道（LUMO）能量降低，从而减小了最高占据分子轨道（HOMO）-LUMO能隙。BQ2–BQ6的FL QY和荧光衰减时间与BQ1相比有所减少，这种趋势在BQ4和BQ6的情况下尤其明显。这种减少主要可归因于重原子效应增强的系间窜越（ISC）过程，该效应在带有碘原子的化合物中最为显著。特别令人感兴趣的是BQ7，其中甲基的引入导致比BQ3更高的发射QY。
受观察到的BQ4-6荧光发射减少的启发（这被假定归因于后者的有效ISC过程），所有化合物的单线态氧（1O2）QY在ACN中使用Ru(bpy)32+作为参考进行了测量。值得注意的是，以存在碘原子为特征的BQ5和BQ6表现出最高的1O2生成效率（1O2QY, ΦΔ= 0.43 和 ΦΔ= 0.42）。将两个溴原子纳入分子骨架（BQ4）导致较低的1O2QY（ΦΔ= 0.28）。有趣的是，不含重原子的硼配合物（BQ1–3,7）也显示出不可忽略的单线态氧生成。这表明这些化合物的非辐射衰减至少部分是通过ISC发生的。
对BQ1–BQ7在凝聚相（包括Zeonex薄膜（5%掺杂）、固态和有机玻璃基质（在77 K的Tol中）的光物理特性进行了进一步综合表征。BQ1–BQ7在薄膜中的吸收和发射光谱与其在溶液相中的相应光谱相比显示出明显的红移。相反，在固态和有机玻璃环境（例如，77 K的Tol、THF和ACN）中，发射峰经历了蓝移。
为了更深入地了解BQ1–BQ7的荧光发射行为，在溶剂、薄膜和固态中用时间相关单光子计数（TCSPC）记录了激发态寿命。在10 μM浓度的Tol中，BQ1–BQ4和BQ7表现出单组分发射特征，具有延长的荧光寿命（值在10.0到24.3 ns之间）。相反，BQ5和BQ6表现出具有单体和聚集体发射双组分的发射。值得注意的是，BQ1–BQ7在薄膜和固态环境中的发射表现出双组分，也暗示了单体和聚集体发射。
为了检查聚集状态下的发射特性，在含有蒸馏水（DW）（0–99%）的THF中研究了BQ7的发射特性。发射峰从528 nm（0% DW时）移动到520 nm（99% DW时），同时在99% DW时强度显著增强（约5倍）。此外，在聚集状态（THF/DW (5/95)）下，使用1,3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）和二氢乙锭（DHE）作为探针评估了BQ7的单线态氧（1O2）和超氧自由基（O2˙?）的生成。有趣的是，在光照下，在BQ7存在下观察到的DPBF吸收减少和DHE强度增加超过了在相同吸光度下Ru(bpy)32+的减少和增加，表明有效的ISC过程和随之而来的ROS生成。因此，BQ7显示出作为荧光成像引导的PDT的有效PS的巨大潜力。
用BQ7传感Cu2+
在文献中，源自8-羟基喹啉（Q）基配体的金属配合物因其在发光材料和生物应用中的广泛用途而引起了相当大的关注，并且通常通过8-羟基喹啉的直接反应合成。在这里，我们探索了基于8-羟基喹啉的硼配合物转化为其相应金属配合物的可行性及其在传感应用中的潜在用途。为此，选择BQ1–7（10 μM）与各种金属阳离子反应，包括Co2+、Ni2+、Fe3+、Cd2+、Cu2+、Al3+、Cr3+、Zn2+、Pb2+和Mn2+（10.0当量），在含有5% THF的DW中进行。有趣的是，引入Cu2+后，观察到BQ7的荧光发射显著猝灭，这通过光谱分析和在365 nm光照射下得到证实。相反，加入其他金属阳离子后，BQ7的发射谱图没有明显扰动。此外，在包括Cu2+在内的金属阳离子存在下，未观察到BQ1–BQ6的荧光发射差异，表明BQ7的选择性传感能力。随后，进行了滴定实验以阐明BQ7和Cu2+之间的相互作用，揭示了发射强度逐渐降低，在0.5当量Cu2+时完全猝灭。Stern-Volmer常数（KSV）和双分子猝灭速率常数（kq）分别计算为0.34 × 10?6M和41.2 M?1s?1。这一观察表明形成了非发光的铜配合物，具体表示为(Q7)2Cu。为了证实这一假设，在丙酮-d6中使用1H-NMR光谱进行了进一步的滴定实验。这些研究揭示了对应于BQ7和氯二苯基硼烷的质子强度同时减少和增加。后者是BQ7与CuCl2反应产生的副产物。值得注意的是，虽然(Q7)2Cu的信号不能以其双峰形式观察到，但其存在通过添加Cu2+（0.2当量）后BQ7的质谱分析得到进一步证实。显著的是，BQ7在与Cu2+相互作用的聚集状态下观察到的“on-off”发射突显了其作为化学传感器和光治疗探针的潜在效用，从而为各种生物应用带来了希望。
计算研究
受BQ7在聚集状态下有趣的光物理性质及其传感能力的鼓舞，对BQ系列进行了量子化学计算。使用密度泛函理论（DFT）和时间依赖DFT（TD-DFT）与Tamm-Dancoff近似（TDA）分别优化了BQ系列的基态（S0）和最低单重态（S1）激发态的几何结构。BQ衍生物的吸收和发射光谱，峰值分别在400-420 nm和500-530 nm，归因于S0→ S1和S1→ S0电子跃迁，这主要涉及HOMO和LUMO。HOMO和LUMO主要定域在喹啉配体和中心硼原子上，苯基配体的贡献最小，证实了S1的局域激发（1LE）特性。此外，优化了(Q7)2Cu配合物的几何结构。(Q7)2Cu配合物的基态对应于双重态，即D1。对(Q7)2Cu前沿分子轨道的分析表明，单占据分子轨道（SOMO）主要位于喹啉配体上，而LUMO分布在喹啉配体和中心铜原子上。(Q7)2Cu的D1确实具有2LMCT特性。2LMCT态通常涉及有效的非辐射失活通道，竞争过荧光或磷光，从而导致发射猝灭。此外，Cu(II)配合物经历Jahn-Teller畸变，特别是在八面体或扭曲四面体几何中。这种畸变导致非刚性结构，通过溶剂中的结构变化增加非辐射弛豫途径，进一步猝灭发射。还通过TDA TD-DFT方法优化了BQ系列的T1和T2三重激发态的最佳几何结构。计算的相对于S0的绝热能差显示在表中。S1的能量显著高于T1而低于T2，表明最可能的ISC途径是S1–T1跃迁。ISC速率常数（kISC）主要取决于所涉及的单重态和三重激发态之间的能隙和自旋-轨道耦合（SOC）。对于BQ1–BQ7系列，S1和T1在能量上相对接近。计算的BQ1–BQ7的S1和T1态之间的SOC也呈现在表中。虽然氯化对计算的SOC值（0.07–0.09 cm?1）没有显著影响，但溴和碘取代显著增加了计算的SOC，这归因于重原子效应，例如，二碘取代的BQ5（0.64 cm?1），二溴取代的BQ4（0.18 cm?1）和单碘取代的BQ6（0.46 cm?1）。因此，BQ5拥有最高的ΦΔ值，而BQ2、BQ3和BQ7拥有与BQ1几乎相同的ΦΔ值。这些计算结果与实验证据定性一致。
此外，SOC并非影响ISC速率的唯一因素。为了获得更定量的一致性，计算了激发态衰减速率常数。使用Franck-Condon（FC）近似计算了S1→ T1跃迁的ISC速率常数，但也包括了Herzberg-Teller（HT）效应。BQ1-7的计算的ISC速率常数可能被低估，这是由于我们的理论方法中忽略了HT效应。毫不奇怪，BQ5拥有最大的ISC速率常数（3.7 × 108s?1），高于BQ4和BQ6，并且显著大于BQ1-3和BQ7。它们的S1–T1能隙相当；因此，在BQ1-3和BQ7中观察到的较低ISC速率常数主要归因于S1和T1态之间较小的SOC。
此外，ISC速率并非影响荧光发射的唯一因素。为了获得ΦF的更定量一致性，还使用FC/HT近似计算了S1→ S0跃迁的荧光速率常数（kfl）。假设非辐射机制主要由S1→ T1ISC过程主导，FL QY可以使用以下方程表示：Φfl= kfl/ (kfl+ kISC)。使用方程（1），计算的FL QY与实验FL QY之间存在定性/半定量的良好一致性，BQ1-3和BQ7具有高值，而BQ4-6具有最低值。例如，BQ1、BQ5和BQ7的实验和计算FL QY值分别为0.62和0.59、0.03和0.01、以及0.41和0.32。这证实了重原子和振动Herzberg-Teller效应在决定PSs的ISC和荧光速率常数方面的相关性。
受BQ7在聚集状态下增强的荧光发射和ROS生成的鼓舞，这可能是由BQ7与其相邻分子（例如，二聚体、三聚体和四聚体）的相互作用诱导的，我们使用PCM（水）中的多层ONIOM模型进行了QM/MM模拟。在其晶体形式中，我们观察到BQ7在两个分子的喹啉和苯基之间表现出π-π堆积相互作用，这被认为是它们之间主要的π-π相互作用。因此，这两个分子（BQ7二聚体）被指定为QM/MM计算中的QM层，而周围的分子被视为MM层。QM/MM优化的起始分子结构从晶体数据中提取。使用QM/MM优化了第一单重态（S1）和三重态（T1）激发态的几何结构。在Franck-Condon几何结构处，S1→ S0和T1→ S0跃迁主要（>96.6%）归因于HOMO-LUMO跃迁，其中HOMO和LUMO定域在同一分子上，表明BQ7二聚体的最低单重态和三重激发态分别具有1LE和3LE特性。值得注意的是，BQ7二聚体中S1的振荡器强度（f = 0.12）大于单体（f = 0.07），证实了BQ7在聚集时发射增强，这可能是由BQ7与其相邻分子的相互作用诱导的。此外，计算得出BQ7二聚体中S1和T1之间的单重态-三重态绝热能隙为0.78 eV，低于单体状态（0.98 eV）。计算得出二聚体中S1和T1之间的SOC为0.13 cm?1，而单体中的SOC显著较小（0.07 cm?1）。注意ISC速率常数（kISC）与SOC成正比，与单重态和三重态之间的能隙成反比。这表明BQ7在二聚体状态下的高效ISC过程可归因于聚集诱导ISC（AI-ISC）机制，这有利于在其聚集状态下通过I型和II型机制生成ROS。
BQ7在活细胞中的荧光传感
受BQ7作为潜在光敏剂和荧光传感器的有趣光物理性质的鼓舞，我们试图评估其在生物系统中的可行性。最初，我们评估了BQ7在活细胞内的荧光。在添加浓度为100 μM的BQ7后，在活细胞室中对活HeLa细胞进行了时间序列成像。BQ7的荧光在处理后约5分钟可检测到，在处理后10分钟达到饱和。这些结果表明BQ7成功扩散穿过细胞膜，其荧光在活细胞内持续存在。值得注意的是，BQ7的荧光模式并非均匀扩散到整个细胞。相反，它似乎积累在某些膜性区室中，促使我们研究BQ7靶向的特定细胞内细胞器，这也可能暗示其潜在的治疗功能。
我们首先检查了活HeLa细胞中的溶酶体和线粒体。将细胞与50 μM LysoTracker Deep Red或100 μM MitoTracker Deep Red以及100 μM BQ7一起孵育。然而，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像显示BQ7与溶酶体或线粒体均缺乏共定位。基于预测的BQ7疏水性、囊泡结构以及在明场图像中观察到的高折射率，我们假设BQ7积累在脂滴中。为了验证这一点，我们用BODIPY 493/503染料对活HeLa细胞进行染色，该染料特异性染色中性脂质并在脂滴中表现出增强的信号。这些样品的CLSM成像显示BQ7和BODIPY 493/503的信号完全重叠。计算得出的BQ7和BODIPY 493/503的Pearson共定位系数为0.5299（n = 4），而MitoTracker Deep Red（n = 3）和LysoTracker Deep Red（n = 4）的系数分别为-0.0136和0.0004。
因此，我们得出结论，BQ7主要与细胞内的脂滴共定位，而不是与线粒体或溶酶体显著相关。这种在脂滴中的特异性积累突显了BQ7独特的细胞内靶向特性，表明其在细胞成像和靶向治疗中的潜在应用。
随后，我们研究了BQ7在活细胞系统中传感Cu2+的可行性。HeLa细胞首先用100 μM BQ7染色。完全染色后，将CuCl2以100 μM的最终浓度加入到细胞生长培养基（含10% FBS的DMEM）中的细胞中。观察到处理后5-10分钟BQ7荧光急剧下降，最终导致荧光几乎完全消失。这些发现明确证明了BQ7在活细胞中传感Cu2+的能力。我们推断BQ7的荧光猝灭是由于形成了不发射的(Q7)2Cu配合物。结合共定位结果，我们提出BQ7可以检测脂滴内的Cu2+阳离子。
活细胞中BQ7的光激活光细胞毒性
在之前的实验中，我们注意到BQ7加照射组的形态学损伤，以及ROS的延迟增加。因此，我们自然要研究BQ7在PDT条件下的细胞毒性。对HeLa细胞进行了剂量依赖性细胞活力测试（BQ7浓度为0-100 μM），有或无光照。在常氧条件下，通过CCK8和分光光度法测量，HeLa细胞显示出剂量依赖性的活力下降
