《Journal of Biological Chemistry》：Enzymatic basis of branching and extension of
O-Man glycans for keratan sulfate biosynthesis
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本研究针对O-甘露糖(O-Man)聚糖分支化酶GnT-IX特异性识别机制及其对下游糖链延伸的影响这一关键科学问题，通过结构比对、定点突变和酶学分析，首次揭示GnT-IX的R304残基是决定其对O-Man聚糖特异性的关键位点，并发现分支化O-Man聚糖为硫酸角质素(KS)生物合成酶B4GALT1、B4GALT4和CHST1提供了高效底物支架，阐明了大脑中O-Man聚糖成熟调控的新机制。
在大脑这个精密复杂的神经系统中，蛋白质的糖基化修饰扮演着至关重要的角色。其中，O-甘露糖(O-Man)聚糖作为大脑中最丰富的O-聚糖类型之一，其结构异常与脱髓鞘疾病、神经胶质瘤等多种神经系统疾病密切相关。然而，长期以来科学家们对O-Man聚糖如何被特异性识别并进一步延伸形成复杂结构的分子机制知之甚少。
这项发表于《Journal of Biological Chemistry》的研究聚焦于两个核心问题：首先，负责O-Man聚糖分支化的关键酶N-乙酰氨基葡萄糖转移酶IX(GnT-IX)如何特异性识别其底物？其次，这种分支化结构如何影响下游糖链的延伸过程，特别是与大脑功能密切相关的硫酸角质素(KS)的生物合成？
为了回答这些问题，研究团队采用多学科交叉的研究策略。关键技术方法包括：基于AlphaFold2的结构预测与分子动力学模拟分析酶-底物相互作用；基因编辑技术构建POMGNT1敲除细胞模型；蛋白质工程表达纯化多种糖基转移酶和磺基转移酶；高效液相色谱(HPLC)进行酶动力学分析；质谱技术鉴定合成糖链结构；利用GnT-IX基因敲除小鼠模型进行体内功能验证；蛋白质印迹和凝集素印迹分析糖基化修饰变化。
GnT-IX R304是识别受体O-Man聚糖的关键位点
通过比较GnT-IX与其同源酶GnT-V的结构特征，研究人员发现GnT-IX的R304残基可能在与O-Man聚糖识别中发挥关键作用。酶活性测定结果显示，将GnT-IX的R304突变为T（对应GnT-V的T288）会导致酶活性显著降低，而将GnT-V的T288突变为R则使其对O-Man底物的活性提高4倍。分子动力学模拟进一步证实，R304通过与O-Man聚糖中甘露糖的O6形成氢键，稳定底物在催化口袋中的构象，从而确保高效的特异性催化。
KS附着于磷酸蛋白聚糖上的分支O-Man聚糖
研究人员发现，在缺乏核心O-Man聚糖合成酶POMGNT1的细胞中，磷酸蛋白聚糖上的KS修饰显著减少。更重要的是，在GnT-IX敲除小鼠大脑中，即使经过软骨素酶ABC和PNGaseF处理，5D4、R-10G抗体和LEL凝集素识别的KS信号仍明显降低，降至野生型小鼠的三分之一水平，这表明O-Man聚糖的分支化对KS的生物合成至关重要。
KS生物合成酶偏好分支O-Man聚糖作为底物
为了阐明分支化促进KS生物合成的分子机制，研究人员纯化了KS生物合成通路中的关键酶（B4GALT1、B4GALT4、B3GNT7、CHST1、CHST2和CHST6），并比较它们对线性和分支O-Man聚糖底物的催化效率。令人惊讶的是，B4GALT1、B4GALT4和CHST1对分支底物的活性分别比线性底物高出23.6倍、4.49倍和13.4倍。动力学分析进一步显示，B4GALT1对分支底物具有更低的Km值和更高的kcat值，表明分支结构确实为KS生物合成提供了更优的酶作用支架。
研究结论与讨论部分强调，这项工作不仅揭示了GnT-IX通过R304残基实现底物特异性识别的结构基础，更重要的是阐明了O-Man聚糖分支化作为"分子支架"促进KS高效合成的生物学机制。这种分支化依赖的糖链延伸模式可能不仅限于KS，还可能影响其他功能性糖 epitope（如HNK-1、LewisX等）在大脑中的表达。考虑到GnT-IX和KS在脱髓鞘疾病、神经胶质瘤和神经退行性疾病中的重要作用，这些发现为开发针对这些疾病的新诊断和治疗策略提供了重要理论基础。未来研究需要进一步解析更长KS链的合成机制，并开发特异性探针以鉴定更多的GnT-IX底物蛋白，从而全面理解O-Man聚糖在大脑中的功能调控网络。
这项研究深化了我们对大脑中复杂糖链生物合成途径的理解，为糖生物学与神经科学的交叉研究开辟了新的方向。
