一种可诱导的系统，用于研究GSX2在人类侧神经节隆起样前体细胞中的调控功能

《Developmental Biology》：An inducible system to study the regulatory functions of GSX2 in human lateral ganglionic eminence-like progenitors

GSX2通过调控染色质可及性和转录活性影响基底神经节发育，本研究构建Dox诱导型hESC系统，发现GSX2主要作为转录 repression因子调控神经元前体成熟及区域特异性分化，为解析GSX2相关神经系统疾病提供新模型。

　　

Edward Farrow|Smitha Rao|Simon J.Y. Han|Xuyao Chang|Cindy Huynh|Samantha A. Brugmann|Hee-Woong Lim|Jason Tchieu|Kenneth Campbell|Brian Gebelein

美国俄亥俄州辛辛那提市辛辛那提儿童医院研究基金会，发育、干细胞与再生医学研究生项目

摘要

动物模型研究表明，同源结构域转录因子Genetic-Screened Homeobox 2 (GSX2) 在基底节发育过程中起着关键作用。最近的临床遗传学研究也表明，GSX2基因变异与严重的神经系统症状和基底节发育不良有关。然而，现有动物模型的技术局限性（如前体细胞的异质性和时间控制的局限性）阻碍了对GSX2直接调控靶点的研究。在本研究中，我们构建了一种Dox诱导型人类胚胎干细胞（hESC）系，以探究GSX2在模拟发育中的外侧神经节隆起（LGE-like）前体细胞定向分化培养中的作用。转录组学、染色质可及性和基因组结合分析表明：(1) GSX2能够结合高可及性和低可及性的染色质，且具有不同的结合位点偏好；(2) 主要通过间接机制改变染色质的可及性；(3) 主要作为转录抑制剂发挥作用；(4) 调控影响神经元前体细胞成熟和区域分化的关键保守靶基因。这些结果揭示了GSX2的关键调控作用和靶点，为研究基底节发育提供了一个新的可行实验系统。

部分内容摘要

背景

许多转录因子（TFs）在发育中的前脑中发挥关键作用，调控区域分化、前体细胞成熟和细胞迁移等过程（Acampora等人，1995；Avilion等人，2003；Corbin等人，2000；Danesin等人，2009；Hirata等人，2006；Lagutin等人，2003；Monuki，2007；Pratt等人，2000；Shinozaki等人，2002；Sussel等人，1999；Toresson等人，2000；Ypsilanti等人，2021）。胚胎脑结构（如神经节）...

方法

本研究中使用的所有商业试剂详见补充表1。

分子克隆：^2xFLAGGSX2构建体由GenScript（新泽西州皮斯卡特韦）合成，插入片段通过KOD Xtreme Hot Start聚合酶进行PCR扩增。为了生成含有^2xFLAGGSX2插入片的AAVS1质粒，我们首先使用MluI和SalI酶切去供体AAVS1 TRE3G–EGFP质粒中的EGFP插入片段（Qian等人，2014）。随后将^2xFLAGGSX2 WT PCR片段连接到...

生成用于研究LGE-like前体细胞中GSX2表达的人类细胞系

以往的基因组研究主要利用生殖系敲除小鼠模型探讨GSX2在基底节基因调控中的作用，但这些模型存在细胞异质性和GSX2作用时间控制不足的问题。为解决这些问题并研究人类GSX2的功能，我们通过TALENs技术在H9（WA-09）人类胚胎干细胞（hESC）系中插入了一个多西环素（Dox-）诱导盒，使^2xFLAGGSX2在AAVS1安全位点表达（图1A）。两个独立的转基因...

新模型用于研究LGE-like前体细胞中GSX2的调控功能

了解GSX2如何调控基因表达以控制腹侧前脑的命运对于更好地理解其对基底节发育的影响至关重要。在本研究中，我们利用基因组编辑、定向分化培养和基因组检测技术建立了一个人类干细胞系统来研究GSX2的功能。首先，我们通过插入一个可诱导表达的GSX2构建体（带有表位标签）对现有的人类ESC系进行了基因改造，从而实现转录基因表达的时间调控。

结论

总之，我们开发的Dox诱导系统能够研究人类LGE-like前体细胞中GSX2的调控功能。研究表明，GSX2主要作为这些人类神经前体细胞中关键神经靶点的直接转录抑制剂。此外，该系统非常适合未来研究GSX2基因变异（与脑畸形和临床症状相关）如何影响其调控能力...

作者贡献声明

Simon J.Y. Han：撰写、审阅与编辑、数据分析。Smitha Rao：方法学设计、实验实施、概念构思。Xuyao Chang：撰写、审阅与编辑、方法学设计。Jason Tchieu：撰写、审阅与编辑、项目监督、方法学设计、概念构思。Hee-Woong Lim：撰写、审阅与编辑、资金获取。Cindy Huynh：撰写、审阅与编辑、方法学设计。Edward Farrow：原始数据撰写

伦理批准与参与同意

使用H9（WA09）人类胚胎干细胞系的实验遵循辛辛那提儿童医院医学中心（CCHMC）胚胎干细胞研究监督（ESCRO）委员会批准的EIP190101协议进行。H9细胞系通过适当许可从WiCell研究所获得。所有研究均符合机构指南、相关法规以及2021年国际干细胞研究委员会（ISSCR）的指导原则。

出版同意

不适用。

数据与材料的公开

本研究生成的所有数据集已上传至NCBI基因表达组数据库（GEO），分别为GSE306348（RNA-seq）、GSE306345（ChIP-seq）和GSE306350（ATAC-seq）。已发表的小鼠数据集可在NCBI GEO中找到，分别为GSE162590（批量RNA-seq）；GSE162589（E12.5 LGE anti-^2xFLAGGsx2 CUT&RUN）和GSE222183（E13.5 全基底节 anti-Gsx2 ChIP-seq）。人类单细胞RNA-seq数据集可在欧洲基因组-表型档案库（EGPA）中找到，编号为EGAD00001006049。

资助

本工作得到了国家神经疾病与中风研究所（R01 NS124660，资助K.C.和B.G.）；国家牙科与颅面研究所（F31 DE033565，资助S.J.Y.H；R35 DE07557，资助S.A.B）；以及CCHMC资助的干细胞与类器官医学中心（CuSTOM）项目的支持（资助K.C.和B.G.）。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

致谢

不适用。