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本研究针对柑橘转基因育种中转化和再生效率低的技术瓶颈，探索了植物激发子肽REF1在柑橘农杆菌介导的转化中的应用。研究发现，合成肽CsREF在100 nM浓度下可将转化效率提高4.8倍，并显著促进再生，为柑橘遗传改良和功能基因组学研究提供了高效技术平台。
柑橘作为全球广泛栽培的重要水果作物，在育种改良中面临诸多挑战。传统育种方法由于柑橘漫长的幼年期及其他限制，在抗病性提升方面进展缓慢。CRISPR介导的基因组编辑技术为植物遗传改良提供了新途径，但在甜橙中由于转化效率和再生效率低下，获得双等位或纯合突变体仍非易事。有趣的是，植物激发子肽（Pep）——再生因子1（REF1）已知能促进番茄的再生和转化效率。那么，REF1能否同样提升柑橘的转化和再生效率呢？这正是本研究旨在探索的核心问题。
为了回答这个问题，研究人员根据甜橙（Citrus sinensis）、葡萄柚（C. paradisi）和番茄中的REF1蛋白序列，合成了相应的肽段CsREF、CgREF和SgREF。他们测试了1 nM、10 nM和100 nM浓度下这三种REF肽对农杆菌介导的转化效率的影响。结果表明，所有三种REF肽均能有效增强柑橘的转化和再生效率。尤为突出的是，100 nM的CsREF处理获得了最高的转化效率，相较对照组提升了4.8倍。这项研究证实，应用REF肽能够显著提高柑橘的转化和再生效率，从而为柑橘的遗传学研究和遗传改良工作扫除了重要障碍。该研究发表于《In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal》期刊。
本研究的关键技术方法主要包括：农杆菌介导的遗传转化技术，用于将目的基因导入柑橘外植体；体细胞胚胎发生和器官发生再生体系，用于从转化后的细胞再生完整植株；以及合成肽处理，通过添加不同浓度的REF肽来优化转化效率。研究使用了柑橘上胚轴作为外植体材料。
研究结果
REF肽增强转化效率
研究人员通过设置不同浓度（1 nM, 10 nM, 100 nM）的CsREF、CgREF和SgREF处理组，并以不加肽的处理作为对照，系统评估了REF肽对农杆菌介导的柑橘上胚轴转化的影响。结果表明，所有三种测试的REF肽均能提高转化效率，其中100 nM的CsREF效果最为显著，使转化效率相比对照组提高了4.8倍。这证明REF肽，特别是CsREF，在优化柑橘转化体系中具有巨大应用潜力。
REF肽促进植株再生
除了转化效率，植株再生是遗传转化成功的另一个关键环节。本研究观察到，经REF肽处理的实验组，其外植体不仅产生更多的抗性愈伤组织，而且这些愈伤组织分化出绿色芽点的能力和后续成苗率也明显高于对照组。这说明REF肽不仅作用于T-DNA的整合过程，还可能通过调控内源激素通路或细胞分裂活性，共同促进了整个再生过程。
研究结论与意义
本研究的结论明确：植物激发子肽REF1（特别是其柑橘同源物CsREF）的应用，可以显著提高柑橘农杆菌介导的遗传转化效率和植株再生效率。这一发现具有重要的理论与实践意义。在理论层面，它揭示了REF肽在木本果树作物中具有保守的促进再生和转化的功能，扩展了我们对植物肽激素功能的认识。在实践层面，建立高效、稳定的遗传转化体系是开展柑橘基因功能研究和分子育种的前提。本研究成功地将转化效率提升了近5倍，这大大加速了利用CRISPR等基因组编辑技术进行柑橘性状改良的进程，例如培育抗病新品种。此外，该技术策略有望推广到其他转化困难的植物物种，为园艺作物的生物技术育种提供了新的技术思路和解决方案。
综上所述，这项研究通过引入REF肽优化转化流程，为解决柑橘遗传转化中的关键瓶颈提供了有效策略，对推动柑橘乃至其他难转化作物的生物技术研究具有重要意义。
