《CNS Neuroscience & Therapeutics》：PGC-1α Transcriptionally Regulated by ChREBP Mitigates Neuropathic Pain Through Promoting Microglial Fatty Acid Oxidation and Anti-Inflammatory Response
ABSTRACT
Background
神经病理性疼痛（NP）是一种由体感神经系统病变引起的慢性疾病，严重损害生活质量。小胶质细胞的代谢重编程和神经炎症是驱动NP进展的关键因素。尽管碳水化合物反应元件结合蛋白（ChREBP）这一关键代谢调节因子已被证实对NP具有保护作用，但其具体机制尚不清楚。
Methods
本研究通过 spared nerve injury (SNI) 手术建立NP大鼠模型，并使用Von Frey纤维丝评估机械性痛觉超敏。通过免疫荧光、RT-qPCR和蛋白质印迹（Western Blot）检测小胶质细胞中ChREBP的表达。功能研究涉及ChREBP的敲低和过表达，以评估其对小胶质细胞极化、神经炎症、神经元兴奋性、疼痛行为及脂肪酸代谢的影响。机制探索通过双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀（ChIP）实验进行。
Results
SNI手术后，大鼠损伤同侧（ipsilateral）的机械痛阈显著降低。ChREBP在SNI后大鼠SDH小胶质细胞以及体外LPS刺激的小胶质细胞（HAPI细胞系）中表达上调。ChREBP敲低抑制了小胶质细胞的抗炎极化，加剧了神经炎症并加重了疼痛。相反，ChREBP过表达则促进了抗炎表型，抑制了神经炎症并缓解了疼痛。ChREBP增强了小胶质细胞的脂肪酸氧化和能量代谢。机制上，ChREBP结合到PGC-1α启动子上的TFBS1位点，激活其转录。PGC-1α过表达能够挽救由ChREBP敲低引起的损害，包括降低的脂肪酸氧化、受抑的抗炎极化、升高的炎症因子以及增加的神经元兴奋性。脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir可减弱ChREBP的保护作用。
Conclusions
ChREBP通过转录激活PGC-1α，增强小胶质细胞脂肪酸氧化和抗炎表型，从而缓解NP，揭示了一条新的代谢-免疫轴，为NP的潜在治疗提供了新思路。
1 Introduction
神经病理性疼痛（NP）是一种复杂的慢性疾病，其特征包括自发性疼痛、痛觉过敏和机械性痛觉超敏。研究表明，NP的总体患病率为9.2%，严重影响患者的日常生活和工作能力。因此，阐明NP的病理机制并发现创新的治疗靶点具有重要的科学价值。
NP的发病机制复杂，涉及整个伤害性通路。脊髓背角（SDH）的小胶质细胞在SNI后迅速被激活。在正常生理状态下，小胶质细胞处于相对静息的状态。当免疫稳态被破坏时，它们极化为两种极端表型：促炎表型和抗炎表型。有趣的是，不同表型的小胶质细胞不仅在形态、细胞数量和基因表达水平上发生显著变化，其代谢模式也截然不同。促炎小胶质细胞依赖有氧糖酵解，而抗炎小胶质细胞则利用脂肪酸氧化（FAO）来促进氧化磷酸化（OXPHOS）。研究表明，抗炎小胶质细胞中较高水平的脂肪酸氧化能增强OXPHOS，提供持续的能量供应，抑制炎症并促进组织修复。因此，增强抗炎小胶质细胞的修复效应可能有助于改善NP。
碳水化合物反应元件结合蛋白（ChREBP）主要调控糖脂代谢相关基因的表达，维持机体糖脂代谢稳态。近年来，研究发现ChREBP在神经系统中不仅参与神经细胞能量代谢的调节，还在神经炎症和神经损伤修复等过程中发挥重要作用。在SNI模型中，外周神经损伤导致局部神经微环境发生变化，包括炎症细胞浸润、细胞因子释放和代谢紊乱。作为对这些病理变化的反应，ChREBP的保护性上调可减轻炎症反应，从而缓解疼痛并促进神经功能恢复。鉴于小胶质细胞代谢重编程对NP发病至关重要，且ChREBP兼具代谢调节和疼痛调控的双重角色，探索ChREBP是否通过靶向小胶质细胞代谢在NP发病中发挥关键作用具有重要意义。
本研究阐明了ChREBP通过促进小胶质细胞脂肪酸氧化、增加抗炎小胶质细胞比例、抑制炎症反应和降低脊髓神经元兴奋性来缓解疼痛的具体机制。研究确定了过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（PGC-1α）是ChREBP调节小胶质细胞代谢和NP的重要下游效应器。本研究阐明了ChREBP通过调节小胶质细胞代谢在NP中的保护作用，并凸显了其作为开发基于代谢的NP治疗新策略的潜力。
2 Methods
2.1 Animals
所有实验均经过南方医科大学珠江医院实验动物伦理委员会审查批准（批准号：LAEC-2022-144），并严格按照国际疼痛研究协会（IASP）制定的实验动物使用伦理指南进行。使用8-10周龄、体重200-250g的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠。
2.2 Construction of the NP Rat Model
采用SNI方法建立NP大鼠模型。大鼠吸入2%-3%异氟烷诱导麻醉，1%-1.5%异氟烷维持麻醉。暴露坐骨神经及其分支（腓总神经、胫神经和腓肠神经），紧密结扎腓总神经和胫神经，保留腓肠神经完整。假手术组仅暴露神经，不进行结扎或离断。
2.3 Stereotactic Injection of AAV Into the SDH
参照Perrine方法进行脊髓立体定位注射。麻醉大鼠后，行椎板切除术充分暴露L4-L6脊髓节段。将立体定位仪坐标重置为零，最终参数设置为X=0.5 mm, Y=0.5 mm, Z=0.5 mm。以0.2 μL/min的速率注射腺相关病毒（AAV）构建体或对照试剂，总体积1 μL。使用的AAV包括靶向小胶质细胞干扰ChREBP的病毒（AAV9-F4/80-shChREBP）、编码ChREBP的病毒（AAV9-F4/80-oeChREBP）和编码PGC-1α的病毒（AAV9-F4/80-oePGC-1α）。
2.4 Intrathecal Catheterization
参照Hou等方法进行鞘内导管置入术。将无菌PE-10导管插入硬膜外间隙并轻柔推进至腰膨大。通过导管注射2%利多卡因10 μL，出现短暂后肢瘫痪证实位置正确。脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir溶解于DMSO后用0.9% NaCl稀释，SNI手术后每天通过导管给予Etomoxir（0.05 mg/kg）或 vehicle（0.9% NaCl），连续14天。
2.5 Behavioral Test
使用Von Frey纤维丝评估大鼠的机械性痛觉超敏。将不同刚度的纤维丝垂直施加于同侧后肢足底表面，逐渐增加力度直至纤维丝弯曲，维持2-5秒。记录缩足、舔足或甩足等反应。根据公式计算50%缩足阈值（PWT）。行为学测试采用盲法进行。
2.6 Immunofluorescence Assay
取L4-L6节段脊髓组织OCT包埋冰冻切片（25 μm）。根据Rexed板层分类将背角划分为I-VI板层。封闭后，与一抗4°C孵育过夜：Iba-1（小胶质细胞标志物）、GFAP（星形胶质细胞标志物）、NeuN（神经元标志物）、ChREBP、PGC-1α、iNOS（促炎标志物）、Arg-1（抗炎标志物）。室温避光孵育相应荧光二抗1小时。封片后使用共聚焦显微镜采集图像，ImageJ软件分析平均荧光强度或阳性细胞数。
2.7 Patch-Clamp Recordings
在冰浴人工脑脊液（ACSF）中制备L4-L6脊髓节段300 μm厚切片。切片在持续通入95% O2/5% CO2的孵育槽中平衡20分钟。在室温下使用EPC 10 USB膜片钳放大器进行全细胞记录。在钳制电位-70 mV下记录自发兴奋性突触后电流（sEPSCs）。数据以10 kHz数字化，2 kHz滤波，使用PatchMaster和Clampfit 10.3软件分析。
2.8 Cell Culture
使用永生化大鼠小胶质细胞系（HAPI）。细胞在含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的DMEM培养基中，于37°C、5% CO2的湿润培养箱中培养。
2.9 Transfection of siRNA and Plasmids
使用靶向ChREBP的小干扰RNA（siRNA）以及ChREBP和PGC-1α的过表达质粒。按照产品说明，使用Namipo转染试剂将siRNA转染入HAPI细胞，使用Lipofectamine 3000转染试剂转染质粒。转染后的HAPI细胞用100 ng/mL LPS刺激24小时。
2.10 Flow Cytometry Analysis
收集HAPI细胞，离心重悬后，加入CD86/APC、CD206/FITC、CD11b/PE抗体，冰上避光孵育15-20分钟。离心、重悬、过滤后，使用流式细胞仪进行分析。
2.11 Seahorse XF Cell Energy Metabolism Assay
使用Seahorse XFe96细胞能量代谢分析仪测量小胶质细胞的氧消耗速率（OCR）。实验前一天，用Seahorse XF校准液水化传感器探针板，并在37°C无CO2培养箱中过夜。同时，将HAPI细胞以每孔10,000个的密度接种于Seahorse XF细胞培养微孔板中。实验当天，更换为pH 7.4的Seahorse XF培养基（补充10 mM葡萄糖、1 mM丙酮酸钠和2 mM谷氨酰胺）。在OCR测量前，细胞用或不用4 μM Etomoxir预处理2小时；随后在基础条件下以及依次加入寡霉素（1.5 μM）、FCCP（1 μM）和鱼藤酮/抗霉素A（0.5 μM）后测量细胞OCR。使用BCA蛋白测定试剂盒测定每孔蛋白含量，以细胞数标准化OCR数据。
2.12 RNA Extraction and RT-qPCR
使用AG RNAex Pro Reagent提取总RNA。使用Evo M-MLV逆转录预混试剂盒将mRNA逆转录为cDNA。使用SYBR Green Pro Taq HS预混qPCR试剂盒定量基因表达，采用2?ΔΔCt方法以β-actin作为内参基因进行数据分析。
2.13 Western Blot
使用总蛋白提取试剂盒提取蛋白质，BCA蛋白测定试剂盒定量。蛋白质经SDS-PAGE分离后转印至PVDF膜。封闭后，与一抗孵育：ChREBP、PGC-1α、CPT1A、ACADM、NRF1、TFAM、β-actin。随后与HRP标记的二抗孵育，使用ECL化学发光试剂显影，Image J软件分析条带。
2.14 PPI Network Construction and Bioinformatics Analysis
使用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，最小相互作用分数阈值设为0.4。将PPI网络导入Cytoscape软件，使用度（degree）算法识别和排序核心基因。使用DAVID在线工具对这些核心基因进行功能分析，包括Gene Ontology（GO）分类和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路富集分析。
2.15 Dual Luciferase Reporter Gene Assay
使用JASPAR网站预测ChREBP在PGC-1α启动子上的结合位点。将空载体（EV）和ChREBP过表达质粒与野生型PGC-1α（WT）或突变型PGC-1α（MUT1：位点1突变；MUT2：位点2突变；MUT3：位点1+2突变）荧光素酶报告质粒共转染入HAPI细胞。使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测量PGC-1α的荧光素酶活性。以萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶的比值计算相对荧光素酶活性。
2.16 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)
使用Simple ChIP酶解染色质免疫共沉淀试剂盒进行ChIP实验。细胞用1%甲醛溶液交联后加入甘氨酸终止。PBS洗涤后收集细胞，离心重悬于含DTT、PMSF和蛋白酶抑制剂的溶液中。混合物用微球菌核酸酶处理，EDTA终止反应。离心后，重悬于ChIP缓冲液并进行超声破碎。将超声破碎后的染色质与IgG、组蛋白H3（阳性对照）和ChREBP抗体孵育。加入ChIP级Protein G磁珠，经过洗涤、洗脱和纯化DNA。使用PGC-1α启动子特异性引物进行RT-qPCR分析。采用比较Ct法计算目标片段的富集倍数，并标准化至Input样本。
2.17 Statistical Analysis
两组间数据比较采用非配对双尾Student t检验。三组及以上数据比较采用单因素方差分析（ANOVA）及Tukey事后检验。行为学实验中缩足阈值的评估采用非参数检验：两组比较用Mann-Whitney U检验，三组及以上比较用Kruskal-Wallis检验。统计学显著性设定为p < 0.05。所有分析使用SPSS 26.0和GraphPad Prism 9软件进行。
3 Results
3.1 ChREBP Expression Is Upregulated in Microglia of SNI Rats and LPS-Stimulated HAPI Cells
采用SNI方法成功建立NP大鼠模型。SNI手术后第3天起，大鼠同侧（Ipsi）痛阈显著降低并持续至术后第21天，而对侧（Contra）痛阈无显著变化。免疫荧光和RT-qPCR结果显示，与假手术组相比，SNI大鼠脊髓背角（SDH）ChREBP表达显著增加，且变化主要集中在I-III板层。免疫荧光共标显示，ChREBP主要与Iba-1（小胶质细胞标志物）共定位，与NeuN（神经元标志物）有少量共定位，与GFAP（星形胶质细胞标志物）不共定位。SNI大鼠SDH中Iba-1+ChREBP+细胞数量增加，而NeuN+ChREBP+细胞数量无变化。在体外，LPS刺激显著上调了HAPI细胞中ChREBP的mRNA和蛋白水平。这些结果表明ChREBP在SNI大鼠SDH小胶质细胞和LPS刺激的HAPI细胞中表达上调，提示ChREBP与小胶质细胞中的NP密切相关。
3.2 ChREBP Mitigates Pain by Mediating Microglial Anti-Inflammatory Polarization and Suppressing Inflammation
为阐明ChREBP在小胶质细胞中的作用，将靶向ChREBP的siRNA转染至LPS刺激的HAPI细胞。转染后，ChREBP的mRNA和蛋白表达均显著下调。流式细胞术分析显示，ChREBP敲低导致CD11b+CD86+/CD11b+CD206+细胞比率增加，表明向促炎表型转变。同时，ChREBP敲低后，LPS刺激的HAPI细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA水平显著上调。相反，将ChREBP过表达质粒转染入LPS刺激的HAPI细胞后，ChREBP mRNA和蛋白表达显著上调。流式细胞术显示ChREBP过表达降低了CD11b+CD86+/CD11b+CD206+细胞比率，表明向抗炎表型转变。此外，ChREBP过表达下调了LPS暴露的HAPI细胞中促炎因子mRNA水平。
为了在体内验证小胶质细胞ChREBP在NP中的作用，在SNI手术前4周将含有F4/80启动子的AAV9载体（AAV9-F4/80-shChREBP用于敲低，AAV9-F4/80-oeChREBP用于过表达）立体定向注射到SD大鼠同侧SDH。免疫荧光共定位实验证实，注射AAV-shChREBP可特异性降低SNI大鼠SDH小胶质细胞中ChREBP表达，而注射AAV-ChREBP则显著增加其表达。RT-qPCR分析进一步验证了ChREBP mRNA水平的变化。为评估小胶质细胞ChREBP调控对体内小胶质细胞极化的影响，使用促炎标志物iNOS和抗炎标志物Arg-1（均与Iba-1共标）进行免疫荧光染色。在SNI + AAV-shChREBP组，Iba-1+iNOS+/Iba-1+Arg-1+细胞比率显著增加，表明向促炎表型转变。相反，SNI + AAV-ChREBP组该比率显著降低，反映向抗炎表型转变。行为学测试显示，小胶质细胞ChREBP敲低导致SNI后第3、7、14和21天同侧机械痛阈显著降低，加剧了NP症状。相反，小胶质细胞ChREBP过表达则显著提高了同侧机械痛阈，缓解了NP。重要的是，AAV注射组对侧痛阈无显著变化。
综上所述，这些体外和体内结果突显了ChREBP在小胶质细胞表型中的调节作用：它促进抗炎极化并抑制促炎反应，从而缓解SNI诱导的NP。
3.3 ChREBP Enhances Fatty Acid Oxidation Rate and Energy Production in Microglia
为阐明ChREBP调节小胶质细胞极化和功能的机制，从STRING数据库筛选出前50个ChREBP相关基因。随后对这些基因进行GO功能注释和KEGG富集分析。GO功能注释结果显示：在生物过程方面，ChREBP相关基因显著富集于脂肪酸稳态、细胞对胰岛素刺激的反应和葡萄糖稳态等条目；在细胞组分方面，富集于染色质、SREBP-SCAP-Insig复合物和细胞质等条目；在分子功能方面，关键功能条目是RNA聚合酶II序列特异性DNA结合转录因子结合。KEGG富集分析进一步表明这些基因主要与AMPK信号通路、胰岛素抵抗、脂肪酸代谢和代谢通路相关。鉴于这些通路均与脂肪酸代谢密切相关，结果表明ChREBP主要参与小胶质细胞的脂肪酸代谢通路。
为评估ChREBP对小胶质细胞脂肪酸代谢的影响，使用Seahorse XF细胞外通量分析仪测量OCR（线粒体呼吸和能量代谢的关键指标）。结果显示，ChREBP过表达显著促进了LPS暴露的HAPI细胞的脂肪酸氧化速率、基础呼吸、最大呼吸和ATP产量。这些发现表明ChREBP在小胶质细胞能量代谢中起关键作用。
从STRING数据库检索的候选基因中，根据Cytoscape软件计算的连通度（connectivity degree）筛选出核心基因。RT-qPCR实验验证了PPI网络中连通度排名前八的核心基因。结果显示，ChREBP显著提高了PPARG、SCD、FASN、PGC-1α、ACACA和PPARA的mRNA水平。SREBF1和HMGCR呈轻微上调趋势但无统计学意义。值得注意的是，PGC-1α的表达增加最为显著。作为脂肪酸氧化的主要调节因子，这种上调可能有助于ChREBP过表达细胞中观察到的更高脂肪酸氧化速率，进一步支持了ChREBP与小胶质细胞脂肪酸代谢之间的联系。
3.4 ChREBP Directly Regulates PGC-1α Expression by Binding to Its Promoter Region
免疫荧光分析显示，在SNI大鼠模型的SDH中，ChREBP和PGC-1α均与Iba-1共定位。此外，体内上调ChREBP促进了ChREBP过表达SNI大鼠同侧SDH中PGC-1α表达的增加。而且，ChREBP过表达的SNI大鼠中PGC-1α mRNA水平上调。观察到ChREBP过表达导致HAPI细胞中PGC-1α蛋白水平显著升高。然而，当将PGC-1α过表达质粒转染入LPS刺激的HAPI细胞时，发现PGC-1α过表达对ChREBP mRNA和蛋白水平影响甚微。根据这些结果，认为ChREBP很可能作用于PGC-1α的上游。
为了进一步确认这种调节作用是否是直接的，进行了一系列实验。使用JASPAR数据库鉴定了ChREBP在PGC-1α启动子区域的转录因子结合位点（TFBS）。TFBS 1位于142-151 bp之间，TFBS 2位于1054-1063 bp之间。随后构建了PGC-1α突变质粒：PGC-1α-MUT1靶向TFBS 1，PGC-1α-MUT2靶向TFBS 2，PGC-1α-MUT3包含TFBS 1和TFBS 2的双重突变。双荧光素酶报告基因实验显示，ChREBP显著增强了PGC-1α的荧光素酶活性，并且TFBS 1被鉴定为ChREBP在PGC-1α启动子上的主要结合位点。使用PGC-1α启动子引物进行ChIP实验检测ChIP DNA产物。结果显示，ChREBP增加了PGC-1α启动子片段的扩增。这些发现表明ChREBP通过结合其启动子区域直接调节PGC-1α
