《Cell Death & Disease》：O-GlcNAcylation of XRCC4 controls its stability and confers resistance to DNA double-strand break damage in cancer cells
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本研究聚焦于DNA双链断裂(DSB)修复关键蛋白XRCC4在癌症中的调控新机制。研究人员发现，O-葡萄糖胺化(O-GlcNAcylation)修饰通过稳定XRCC4蛋白水平，显著增强癌细胞对DNA损伤的抵抗能力。该研究首次鉴定出XRCC4 Thr308为其主要O-葡萄糖胺化位点，并揭示该修饰通过抑制E3泛素连接酶TRIM21介导的K48多聚泛素化降解途径，从而增强XRCC4稳定性。这一发现为开发针对DNA损伤修复通路的新型癌症治疗策略提供了重要理论依据。
在癌症研究领域，DNA损伤修复机制一直是科学家们关注的焦点。众所周知，基因组不稳定性是驱动肿瘤发生的关键因素，但同时也构成了癌细胞的"阿喀琉斯之踵"。化疗、放疗以及肿瘤微环境中的缺氧和营养缺乏状态都会导致DNA损伤的累积，特别是最具细胞毒性的DNA双链断裂(DSB)。为了生存，癌细胞进化出了高效的DNA损伤应答(DDR)机制，其中非同源末端连接(NHEJ)是哺乳动物细胞修复DSB的主要途径。
在这一修复过程中，X射线修复交叉互补蛋白4(XRCC4)作为NHEJ通路的核心组件，与DNA连接酶IV(LIG4)形成复合物，对断裂的DNA末端进行连接，在癌细胞化疗抵抗和生存中发挥着关键作用。有趣的是，先前的研究发现XRCC4在多种癌症细胞和组织中高表达，而另一种重要的蛋白质修饰——O-葡萄糖胺化(O-GlcNAcylation)水平在癌症中也异常升高。这种修饰作为营养和应激传感器，动态调节着多种细胞过程。然而，这两种现象之间是否存在内在联系，以及它们如何共同影响癌症进展，始终是未解之谜。
韩国延世大学的研究团队在《Cell Death and Disease》上发表的这项研究，首次揭示了O-葡萄糖胺化对XRCC4功能的直接调控机制。研究人员发现，XRCC4在Thr308位点的O-葡萄糖胺化修饰通过抑制TRIM21介导的泛素-蛋白酶体降解途径，显著增强了XRCC4的稳定性。这一机制在DNA损伤条件下尤为关键，使癌细胞能够有效修复DSB，从而产生治疗抵抗。更重要的是，该修饰还促进了癌细胞的增殖、侵袭和体内肿瘤生长。
为开展这项研究，研究人员运用了多种关键技术方法：通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建XRCC4基因敲除细胞系；利用质谱分析鉴定XRCC4的O-葡萄糖胺化位点；采用蛋白质免疫共沉淀和体内泛素化分析研究蛋白质相互作用和修饰；建立异种移植小鼠模型评估肿瘤生长；使用报告基因系统分析NHEJ和同源重组(HR)修复效率；并通过细胞活力、侵袭和软琼脂克隆形成实验评估癌细胞恶性表型。
XRCC4蛋白水平受细胞O-葡萄糖胺化水平调控
研究发现，在结肠癌组织和多种癌细胞系中，XRCC4蛋白和O-葡萄糖胺化水平均显著升高。通过药理学和遗传学手段调控O-葡萄糖胺化水平，研究人员证实了其与XRCC4蛋白表达的正相关关系。值得注意的是，高葡萄糖条件能增强XRCC4表达，而OGT过表达可逆转低葡萄糖条件下XRCC4的下调。
细胞O-葡萄糖胺化水平通过影响泛素依赖性蛋白酶体降解来调节XRCC4稳定性
机制研究表明，O-葡萄糖胺化并不影响XRCC4的mRNA水平，而是通过调控蛋白质稳定性发挥作用。环己酰亚胺(CHX)追踪实验显示，提高O-葡萄糖胺化水平可延长XRCC4蛋白半衰期。蛋白酶体抑制剂MG132能逆转OGA过表达引起的XRCC4下调，且降低O-葡萄糖胺化水平会显著增加XRCC4的K48连锁多聚泛素化。
TRIM21介导的XRCC4泛素依赖性蛋白酶体降解受细胞O-葡萄糖胺化水平调控
通过互作组分析，研究人员将TRIM21鉴定为XRCC4的E3泛素连接酶。TRIM21敲低可增加XRCC4水平，而其过表达则降低XRCC4水平。重要的是，TRIM21敲低可逆转OGA过表达引起的XRCC4降解。机制上，O-葡萄糖胺化水平降低增强了XRCC4与TRIM21的相互作用，而不影响TRIM21本身的表达水平。
Thr308是XRCC4的主要O-葡萄糖胺化位点
研究人员通过质谱分析鉴定出XRCC4的四个O-葡萄糖胺化位点：S303、S304、T308和S309。其中，Thr308位点的突变(T308A)对O-葡萄糖胺化水平影响最为显著，表明其为XRCC4的主要O-葡萄糖胺化位点。该位点在多个物种中高度保守。
Thr308 O-葡萄糖胺化调控XRCC4稳定性
在XRCC4敲除细胞系中稳定表达XRCC4 WT或T308A突变体，发现T308A突变体的O-葡萄糖胺化水平和蛋白表达均降低。虽然mRNA水平无显著差异，但XRCC4 WT的半衰期明显长于T308A突变体。同时，T308A突变体的K48多聚泛素化水平更高，且与TRIM21的相互作用更强。
XRCC4 Thr308的O-葡萄糖胺化调控癌细胞对DNA双链断裂损伤的抵抗
博来霉素诱导的DNA损伤实验显示，XRCC4 Thr308的O-葡萄糖胺化在DNA损伤应答中起关键作用。XRCC4 WT表达细胞能更有效地修复DSB，表现为γH2AX水平更快下降，而T308A突变体细胞修复效率低，细胞死亡率高。细胞活力实验进一步证实，XRCC4 Thr308的O-葡萄糖胺化显著增强癌细胞对博来霉素的抵抗能力。
XRCC4 O-葡萄糖胺化促进癌细胞增殖和肿瘤生长
功能实验表明，XRCC4 Thr308的O-葡萄糖胺化显著促进癌细胞增殖、侵袭和软琼脂克隆形成。动物实验进一步证实，表达XRCC4 WT的细胞形成的肿瘤明显大于T308A突变体组，表明该修饰对体内肿瘤生长至关重要。
本研究系统阐明了O-葡萄糖胺化在调控DNA损伤修复中的新机制。XRCC4 Thr308的O-葡萄糖胺化作为关键分子开关，通过抑制TRIM21介导的泛素化降解，稳定XRCC4蛋白水平，从而增强癌细胞对DNA损伤的修复能力和治疗抵抗。这一发现不仅深化了对蛋白质翻译后修饰调控DNA损伤应答机制的理解，更重要的是为癌症治疗提供了新靶点。针对XRCC4 Thr308 O-葡萄糖胺化的特异性干预策略，有望成为增强传统化疗和放疗疗效的有效手段，为克服肿瘤治疗抵抗提供了新的思路。
