PknS激酶直接磷酸化σ因子EcfK调控细菌VI型分泌系统抵抗原生动物捕食的机制研究

《The FEBS Journal》：A Hanks-type bacterial kinase, PknS, directly phosphorylates the alternative sigma factor EcfK to promote resistance to protist predation

本综述系统阐述了植物病原菌Xanthomonas citri中Hanks型激酶PknS通过直接磷酸化替代σ因子EcfK（ECF43家族成员），激活VI型分泌系统（T6SS）以抵抗土壤阿米巴捕食的新型信号通路。研究揭示了PknS自磷酸化特性及其激酶结构域保守性，鉴定了EcfK上五个关键磷酸化位点（包括σ2结构域T51和连接区T104/T106/S108/S110），并通过结构预测阐明磷酸化介导的RNA聚合酶结合机制。该发现为细菌转录调控和病原体-环境互作提供了新视角。

　　

PknS是典型的Hanks型受体激酶，可催化自磷酸化

PknS作为跨膜受体激酶，其胞质区包含激酶结构域，C端周质区具有三个TPR结构域。序列比对显示PknS激酶结构域具有Hanks型激酶典型的11个保守亚域（I-XI）及关键功能模体：负责ATP结合的GxGGMG P-loop、催化环H/YRDXKXXN（其中天冬氨酸为催化残基）以及包含DFG模体、磷酸受体苏氨酸和P+1 APE/SPE模体的激活环。体内实验表明，缺失周质域的截短版本（PknS_1–364和PknS_1–449）在X. citri细胞中发生磷酸化，而全长PknS在无诱导信号时无磷酸化，提示周质域对激酶活性具调控作用。功能互补实验证实周质域对PknS介导的T6SS激活不可或缺。

PknS_1–364的结构解析

通过筛选人类激酶抑制剂库，发现CHIR-124与PknS_1–364M₁₆₄A（门控残基突变体）结合。共晶结构（2.1 ?分辨率）显示PknS采用经典Hanks型激酶折叠：N端叶以β链为主，C端叶以α螺旋为主，通过铰链区连接形成ATP结合位点。结构比对显示PknS与结核分枝杆菌PknA/PknB及人类BRAF激酶具有相似性（RMSD 1.5-2.0 ?）。CHIR-124通过喹啉酮基团与铰链区Leu167主链形成氢键，其苯基咪唑和喹啉酮与Ile91、Val99等残基发生疏水相互作用。门控突变M164A扩大了ATP结合口袋容积，而野生型PknS则与更小分子Tyrphostin 9结合，表明其结合位点具有立体选择性。

PknS直接磷酸化ECF σ因子EcfK

体外磷酸化实验证实PknS_1–364可直接磷酸化EcfK，质谱检测到最多五个磷酸化事件。LC-MS/MS分析鉴定出五个磷酸化位点：保守σ₂结构域内的T51，以及连接σ₂与σ₄结构域的非保守区T104、T106、S108和S110。其中T106在ECF43家族中高度保守（76.9%成员含Ser/Thr或带负电荷残基）。与霍乱弧菌EcfP仅有一个磷酸化位点（对应T51）不同，EcfK存在多位点磷酸化调控。

磷酸化的生物学效应：T51和T106位点突变 abolish EcfK激活

通过阿米巴捕食实验评估EcfK突变体功能，发现双突变体ecfK^T51A/T106A完全丧失抵抗捕食能力，而其他双突变体（T51A/T104A、T51A/S108A、T51A/S110A）仍具功能。表明T51或T106任一磷酸化即可激活EcfK。免疫印迹验证突变体蛋白稳定性未受影响。

EcfK Thr106磷酸化对RNA聚合酶相互作用的关键作用

AlphaFold 3预测X. citri全酶复合物结构显示，磷酸化T106（pThr106）位于RpoC表面正电荷口袋内，可能与Arg322和Lys325形成氢键。相比之下，pThr51虽与RpoC Arg297相互作用，但其周围极性残基（Arg33、Gln49等）可形成替代性氢键网络，解释T51A突变体仍具功能的原因。对比其他X. citri σ因子发现，其中六个在等效位置含带负电荷残基，模拟pThr106的相互作用模式。

讨论

本研究揭示了PknS-EcfK-T6SS信号通路在细菌环境适应中的新颖调控机制。与结核分枝杆菌SigH磷酸化不同，ECF43家族σ因子可能通过单一位点（如V. parahaemolyticus EcfP）或双位点（如X. citri EcfK）磷酸化实现激活，这种差异可能影响信号响应动态范围。PknS周质域在激酶激活中的调控作用及其在捕食信号感知中的功能有待进一步探索。该研究为细菌转录调控及病原体-环境互作提供了新的分子视角。