《Journal of Neurochemistry》：Neurons in a Dish: A Review of In Vitro Cell Models for Studying Neurogenesis
2 神经发生研究中的细胞模型
2.1 原代脑细胞培养
原代脑细胞培养物通常来源于脑组织的解离，产生包括神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞、神经干细胞和祖细胞在内的异质性细胞群体，这些细胞在体内容易被发现。从胎儿脑组织获得的人原代培养物比啮齿类动物培养物具有更高的生理相关性，但由于伦理问题、技术难度和商业可用性有限，研究多依赖来自啮齿类动物大脑的原代细胞培养物。这些培养物对于研究神经发生的特定事件特别有用，因为在胚胎大脑发育过程中，细胞仍在分化，允许研究人员研究从祖细胞到完全分化的神经元的转变。然而，胚胎组织随着发育变得越来越异质化，导致不同解剖和阶段的细胞群体不同。准确解释每个胚胎神经源性部位的细胞组成和分化阶段至关重要。
虽然原代培养不能完全概括神经发生，但分离和表征多能NSCs对于早期机制研究仍然有价值。这些细胞可以在啮齿动物胚胎早期（约E10.5）从早期大脑结构中分离出来，但大多数研究使用稍晚发育阶段（如E15.5）的细胞，此时大脑区域更清晰，可获得更多适合培养的活细胞。与从胚胎脑区分离多能NSCs不同，一些方案提供了从成年啮齿动物的常规神经源性微环境中直接分离NSCs的宝贵见解，为研究成年神经发生提供了更有价值的模型。但尽管NSCs是研究神经发生的金标准，一些研究报告称，一旦培养，这些细胞可能会重新获得胶质特征或失去微环境依赖的可塑性，这降低了它们的相关性。
从发育中大脑或成年神经源性微环境分离的NSCs因其未分化状态而被认为是理想的，这使得研究人员能够概括神经发生的全过程。但相反，许多研究依赖于从其他脑区（如海马体和皮层）获得的祖细胞，通常在更晚的胚胎发育阶段，这通常是出于实际原因。这种方法既有技术上的动机，也有生物学上的动机：这些区域通常更容易获取，含有更多已经定向于特定神经元谱系的祖细胞，并且更容易解剖，这意味着可获得更多活细胞，从而提供更可重复的结果。此外，研究特定区域的祖细胞使研究人员能够探索神经发生如何受到局部微环境的影响，为了解正常大脑发育甚至区域特异性神经病理学提供了见解。
神经发生的过程在神经源性区域是相似的，但需要考虑细胞机制上重要的区域差异。例如，皮层提供了一个时间上更分离和可预测的模型，其中神经元产生在出生后显著下降。相比之下，在海马体，特别是在齿状回（DG）中，神经发生以高速率持续，出生后头几天标志着高神经元产量。海马体中持续到成年期的神经发生对于记忆形成和突触可塑性至关重要。同时，皮层神经发生主要局限于早期发育阶段，反映了皮层依赖已建立的回路进行感觉处理、运动控制和认知。尽管海马体神经发生持续存在，但早期的海马体解剖通常更受神经源性研究的青睐，因为出生后大脑包含更成熟的神经元和活跃的突触可塑性，这些细胞增殖能力较差，分化能力降低。尽管如此，使用出生后神经元相对于胚胎神经元有优势：它们最大限度地减少了动物牺牲（不需要牺牲母鼠），更容易进行基因操作，并且对于研究早期产后致死性的基因工程小鼠特别有用。
尽管靶向的脑区不同，但分离、铺板和维持细胞培养的方法相似，但支持细胞生长和分化所需的具体神经营养因子因特定细胞类型而异。例如，脑源性神经营养因子（BDNF）是维持皮层神经元大小和树突结构所必需的，虽然它传统上也被认为是海马神经元的主要神经营养因子，但敲除BDNF受体（原肌球蛋白受体激酶B，TrkB）对海马神经元存活影响最小。
如前所述，神经元产生在胚胎发育早期达到高峰，但一些方案仍然倾向于使用较晚胚胎天的组织，因为早期胚胎组织较小且分离更困难。皮层和海马体培养物通常从E17–E19大鼠胚胎或E15–E16小鼠胚胎制备，产生 mostly 神经元，这些神经元保留与体内观察到的相似的形态特征。在这些阶段，神经元产生基本完成，确保了新分化神经元的包含。组织收集时间有助于提高细胞同质性，改善实验一致性。尽管在这些后期阶段，皮层和海马体神经发生接近完成，但在这些时间点分离神经元仍然是研究神经发生最后步骤（如这些细胞的分化和成熟过程）的有价值选择。
2.1.1 培养配置
由于神经发生的复杂性，大多数研究团队使用更简单的培养系统，例如二维（2D）培养，这仍然是最广泛使用的体外模型。除了成本效益外，2D环境还与各种实验工具兼容，能够对单个细胞进行精确操作和观察。平面配置使细胞更容易接触到分子探针、基因操作技术和其他处理，确保对整个细胞群产生一致的效果。这种可及性和简单性使得跟踪特定基因表达模式、信号通路或随时间变化的形态变化变得容易得多。此外，不同的研究团队已经建立了铺板后神经元发育的顺序，提供了神经元在体外如何发育、分化和成熟的逐步检查，详细描述了它们分化的每个阶段——从初始生长到轴突和树突形成、分支和成熟。通过在受控环境中精确定位神经元所处的阶段，研究人员可以更准确地研究影响神经元发育和分化的特定分子、遗传或环境因素。
根据实验目的，2D培养可以设置成不同的配置：单一培养和共培养（直接或间接）。
如前几节所述，因为脑组织包含不同阶段的不同细胞类型，原代培养通常产生包含多种细胞类型的异质性群体，而不是纯的神经元群体。多年来，已经发表了大量详细的方案，涵盖了过程的每一步，从不同胚胎阶段的组织解剖到将组织解离成单细胞并在体外生长。它们的流行源于其技术简单性以及神经元通常保持存活2-4周的事实。尽管标准原代啮齿类神经元培养物的培养寿命通常限于体外几周，之后会出现显著的神经元损失，但专门的方案可以将存活期延长至1-2个月，甚至5个月。然而，这些方法通常被认为技术要求高，突显了长期维持尚非惯例。文献中经常缺乏对这些分化结果的定量报告，这阻碍了不同方案之间的直接比较，并限制了为富集特定神经元亚型及其效率选择最合适方案的能力。然而，混合培养物中的神经元通常比纯神经元培养物更稳健，因为存在胶质细胞，特别是星形胶质细胞，它们对神经元的存活和功能至关重要。此外，这种异质性增强了这类培养物的复杂性，使其成为更接近体内观察到的细胞多样性和相互作用的代表性模型。
然而，使用混合培养物引入了显著的缺点，特别是在变异性方面，因为神经元与胶质细胞的比例在不同解剖之间可能不同，导致具有不同细胞组成的培养物，并可能混淆实验结果。这种变异性还因经常缺乏神经元与胶质细胞比率的定量报告而加剧。在未来的研究中纳入这些数据至关重要，因为它使研究人员能够评估培养物组成，跨研究比较结果，并为特定的科学问题选择最合适的方案。这些数据可以通过简单的神经元（例如βIII-微管蛋白）和胶质细胞（例如GFAP）免疫细胞化学标记结合手动计数或自动图像分析获得。这些参数的标准化报告将极大地提高可重复性并促进跨方案比较。
确实，不同培养制备中胶质细胞含量的差异会显著影响神经元的行为和功能。这种固有的变异性使实验结果的再现性复杂化，并削弱了得出一致结论的能力。此外，神经元一旦分化就失去分裂能力，而胶质细胞在某些脑区数量超过神经元，在培养中保留持续分裂的能力。胶质细胞的这种增殖特性可能进一步干扰或掩盖基于神经元的观察。为了应对这些挑战，大多数可用方案已经过优化，以选择性富集神经元，通常通过基于粘附的选择、使用特定的生长因子或通过化学处理（如5-氟-2'-脱氧尿苷或阿糖胞苷）来阻止培养物中胶质细胞的生长。然而，这些策略并不能完全解决变异性问题；它们只是有助于减少它。
有一些可用的替代技术可能有助于建立完全由神经元组成的神经元培养物。一些研究描述了使用各种神经细胞计量方法来分离和维持神经元培养，每种方法都有其独特的优点和局限性，本文将不详细讨论。作为参考，这些方法包括例如荧光激活细胞分选（FACS）、磁性激活细胞分选（MACS）、免疫盘法等。尽管单一培养系统为研究没有其他细胞类型干扰的神经元发育提供了受控环境，使其对神经发生的机制研究特别有价值，但这些培养物无法支持长期存活。
总体而言，很明显，创建有效的神经元培养物面临一个困境：虽然神经元需要胶质细胞才能存活，但拥有异质培养物使得难以控制细胞群体，这破坏了实验的一致性。没有胶质细胞，神经元会迅速恶化；有了它们，研究人员就失去了确保来自神经元的可重复数据的能力。这种不可避免的权衡使为可靠研究创建理想神经元培养物的努力复杂化。区室化的2D共培养已成为实现这种平衡的有前途的方法。这些方法涉及使用物理屏障分离细胞类型，实现信号分子的交换，同时保持有限或没有直接的细胞-细胞接触。最简单的方法涉及将来自单独胶质培养物的上清液（条件培养基）转移到神经元培养物中，但这种饲养细胞样系统可以通过增加复杂性水平来实现。例如，胶质细胞可以培养在含有神经元培养物的培养皿内的盖玻片上，或者在相邻的区室中，例如多孔膜插入物（Transwell）。其他研究人员将星形胶质细胞培养在纤维素滤纸上，并将其悬浮在神经元网络上方，允许神经元受益于关键的星形胶质细胞分泌因子而无需直接接触，这提高了神经元活力和密度。微流体平台是另一个明显的解决方案，因为它们不仅可以分离神经元与其他细胞，还可以分离神经元的不同区段，这对于研究神经发生的特定阶段（如树突和轴突形成）很有用。
除了增强神经元存活和减少实验间变异性外，共培养系统还为了解其他细胞类型如何影响神经元特性提供了宝贵的见解。值得注意的是，共培养中胶质细胞的存在也被证明可以提高神经元转染效率。
2D培养系统提供了一些毋庸置疑的优势，但它们未能捕捉到脑组织固有的空间组织和结构线索。在体内，三维（3D）结构提供了调节神经发生过程中增殖、分化、迁移和回路整合的基本外部信号。因此，通常需要更复杂的3D培养系统来更忠实地再现大脑的微环境动态和功能复杂性。众所周知，3D培养系统比传统2D培养具有众多优势，这一概念在细胞培养和组织工程领域已探索多年。虽然3D培养的一般好处已得到广泛认可，但本节仅旨在概述可用于培养原代培养物的各种3D策略及其指导未来研究的潜力。
原代神经元与其他支持细胞一起可以被包裹在水凝胶中，水凝胶在凝胶化时形成不同的3D结构，目前天然和合成水凝胶都用于此目的。除了提供比传统2D培养更生理相关的环境外，其生物力学操作允许研究人员控制不同的细胞行为，包括细胞命运。例如，较软的水凝胶倾向于促进诱导性NSCs向神经元分化，而较硬的水凝胶则鼓励其向胶质细胞分化。不同水凝胶特性如何影响神经元行为的详细分析可以在别处找到。尽管有这些优点，在3D培养中使用水凝胶对成像提出了挑战，限制了高分辨率可视化细胞相互作用和结构的能力。
还有其他无支架系统也为研究神经发生的不同阶段提供了生理相关环境。例如，神经球，也称为神经球状体或神经聚集体，是一种经典的3D培养神经元的方法，常用于研究神经发生的早期阶段。在这种细胞培养配置中，神经球是通过在胚胎发育早期（当NSCs最丰富和活跃时）从各种脑区铺板原代培养物形成的，或者 alternatively，通过分离仍保留这些NSCs的成年啮齿动物的神经源性微环境。这些异质的自由漂浮聚集体由多种细胞组成，包括NSCs和祖细胞，以及一些早期分化的神经元/胶质细胞，所有这些都嵌入在三维组织的复杂细胞外基质中。这些细胞在无粘附条件下铺板，在确定的、无血清的培养基中，富含有丝分裂原如表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），这些因子支持其存活和增殖，同时保持其未分化状态。这种方法的一个额外优点是细胞以后可以转换回2D培养以进行进一步的实验。
组装在神经球中的细胞可以保持高增殖能力，意味着它们可以扩增并维持多代（最多60代）于未分化状态，当需要时， upon 撤除前述有丝分裂原，可以分化为神经元谱系。有丝分裂原撤除后，神经元分化可在10天内发生，报告的效率因培养条件而异。例如，一些研究报告神经元效率低至10%，在暴露于丙戊酸后可以增加到60%。
这种简单的培养方法为研究NSCs的行为、监测可能触发神经元产生的因素以及测试它们在不同环境中的反应提供了一个有效的平台，可用于研究神经元命运特化。一个额外的优点是，有多个优化的方案可用于从胚胎和成年来源生成神经球。为了更好地理解这种技术，并在进行任何实验之前，研究人员应参考Silva Siqueira等人的综述文章，该文章对神经球测定方案的每一步进行了全面分析。尽管其广泛使用，许多变量影响神经球内细胞组成的异质性，这影响了测定之间的再现性，对其广泛应用构成了挑战。
除了神经球，其他无支架、自组织结构也被证明对模拟神经发生有价值，例如脑类器官，它具有比神经球高得多的结构复杂性和细胞多样性。这种细胞组织水平无法使用神经元实现，因为它们缺乏多能干细胞的干性和自组织能力。然而，最近的一项研究表明，从小鼠海马脑类器官可以从原代神经元培养物中产生。这是通过富集从C57BL/6J小鼠在E14.5（小鼠神经元产量高的发育阶段）的SGZ分离的NSCs实现的。尽管有这个例外，多能干细胞通常是这种细胞培养配置的标准起始材料，这将在第2.3.1节进一步讨论。
2.2 永生化细胞系
如前所述，虽然原代培养在生理特性上接近体内神经元和干细胞，但它们有几个局限性。原代神经元尤其具有有限的寿命、生长速度慢，并且在培养中随时间推移可能失去其表型。此外，虽然可以使用专门的方案将DNA引入这些细胞，但它们通常对基因操作更具抗性。最后，关于动物实验的伦理考虑也限制了它们的使用。为了克服这些挑战，研究人员经常使用来自神经元组织的永生化细胞系，无论是由于其癌性起源还是通过特定处理和基因修饰诱导的。
许多人类和啮齿动物来源的永生化细胞系能够获得神经元表型，包括胚胎癌细胞系（例如P19、F9、NTERA-2）、嗜铬细胞瘤细胞系（例如PC12）和神经元来源的细胞系（例如SH-SY5Y、IMR-32、B35、CAD、HT22、C17.2、N2a）。这些细胞系在神经生物学研究中被广泛使用，不仅因为它们的培养相当简单，具有无限增殖潜力，而且还表现出一些神经元中常见的特征，包括神经递质、离子通道、受体和不同的神经元特异性蛋白。此外，这些细胞系中的大多数经过基因修饰以提供遗传同质性和在多代中的稳定性，这提供了减少生物变异性和增强实验中可靠性和再现性的优势。然而，这些细胞系的固有生理学与原代神经元显著不同。为了缓解这一点，它们的培养条件经常被修改（例如通过添加特定的生长因子）以诱导它们向更类似神经元的表型分化。尽管如此，尽管它们具有遗传一致性，这些分化方案可能引入表型变异性，因为过程的有效性可能不同。
在可用于神经生物学研究的大量永生化细胞系中，人源细胞系特别有价值，因为它们密切复制人类基因和蛋白质表达，包括与神经发生相关的人类特异性蛋白质亚型，这些特征在啮齿动物原代培养或啮齿动物永生化细胞系中不存在。此外，具有非神经元起源的细胞复制真实神经元的分子和功能特征的能力有限。综上所述，人神经母细胞瘤细胞系目前代表了研究人类神经元功能潜在机制的最合适的永生化细胞系。因此，这些模型将在以下章节中更详细地讨论。
2.2.1 神经母细胞瘤细胞系
神经母细胞瘤来源的细胞呈现两种不同的形态表型：S型，贴壁/上皮样细胞，和N型，神经母细胞样细胞，它们可以贴附或漂浮在培养液中。N型细胞通常是实验的首选，一些方案建议仅使用漂浮细胞以获得类神经元表型。这可以通过最小化胰蛋白酶孵育时间来实现，胰蛋白酶选择性解离对胰蛋白酶更敏感的N型细胞，而上皮样S型细胞则留在培养皿上。N型细胞在神经科学研究中通常更受青睐，因为它们有能力表达广泛的神经元标记物，这些标记物在上皮样细胞中不存在。此外，即使在未分化状态下，这些细胞也以极低水平表达胆碱能和谷氨酸能标记物。
当用不同的分化诱导剂处理时，它们的增殖速率下降，并且它们倾向于采用更类似于原代神经元的形态。它们延伸出长、细且分支的细胞质突起，类似于神经突，据推测参与建立类似突触的连接，这是神经元的一个关键特征。此外，用特定的分化因子补充培养基促进了神经元标记物的表达，这些标记物是这些细胞系采用的类神经元表型的特征。
但除了使用的分化剂之外，几位作者强调方案的持续时间在决定这些细胞的表型和成熟度方面也起着关键作用。虽然大多数方案使用7天来分化SH-SY5Y细胞，但几项研究表明，如此短的持续时间通常仅产生部分分化的细胞，不能完全捕捉成熟神经元的特征。为了更好地模拟具有广泛神经突生长和功能特性的完全成熟神经元，一些研究建议使用更长的分化方案，这些方案已被证明可产生终末分化的、类神经元细胞。尽管一些研究可能表明SH-SY5Y细胞可以表达成熟神经元标记物，但电生理学研究表明这些细胞缺乏成熟神经元特征的复杂电活动，表明这些细胞未实现完全的功能成熟。虽然这是一个极其多能的细胞系，具有多种优势，但这些是高度敏感的细胞，比其他永生化细胞系增殖更慢，使得它们的培养和在常规实验室实验中的使用相当具有挑战性。
分化SH-SY5Y细胞时最后一个重要的考虑因素是传代次数，许多方案没有具体说明。表1中报告的大多数研究使用早期传代细胞（≤20），而其他研究使用更高传代的细胞。这些细胞可能不显示经典的衰老迹象，但它们的生化特性受传代次数影响显著，建议在所有实验中将其保持在20以下以确保一致性和可靠性。
IMR-32细胞也保留分化为类神经元细胞的能力，并与SH-SY5Y细胞共享许多特征。然而，据报道，它们的神经递质谱不太多样化，并且分化时显示较短的神经突生长和较少的形态转变，因此它们不太常用于成熟神经元模型。在一项比较RA对SH-SY5Y和IMR-32细胞系影响的蛋白质组学研究中，检查了这些细胞在分化过程中的分子变化。虽然两系显示出大致相似的蛋白质组反应，但出现了一些差异。例如，像预折叠蛋白亚基6（PFDN6）和热休克蛋白家族A成员14（HSPA14）这样的分子伴侣在SH-SY5Y细胞中下调，但在IMR-32细胞中上调。这种对比可能表明SH-SY5Y细胞经历了更有效或压力较小的分化过程，使它们更适合研究正常的神经元脑过程，如神经发生。相反，IMR-32细胞中分子伴侣表达的增加可能反映了更高的蛋白质毒性应激，可能限制了该模型反映生理神经元行为的准确性。
与SH-SY5Y细胞不同，IMR-32细胞对RA诱导的分化表现出一定的抗性，这可能归因于它们扩增的MYCN基因通过几种建议的机制干扰RA作用，例如通过抑制RA反应基因、维持细胞周期进程和增强RA降解。这种抗性也得到了Burdge等人的证实，他们还发现某些脂肪酸（尽管浓度高于RA）比RA促进更广泛的神经突生长。另一项研究也报道，只有当肿瘤蛋白D52（TPD52）表达时，RA处理才能诱导这些细胞中的神经元分化途径，这表明仅RA不足以促进这些分化相关的变化。此外，替代化合物如5型磷酸二酯酶（PDE5）抑制剂（西地那非和IS00384）已被证明通过激活与RA触发的信号通路（特别是AMPK和PI3K/Akt）重叠的信号通路来促进IMR-32分化，这提供了克服在MYCN扩增的IMR-32细胞中观察到的RA分化抗性的潜在替代方案。
总之，SH-SY5Y和IMR-32细胞都是研究神经元分化的有价值的人神经母细胞瘤细胞模型。SH-SY5Y细胞表现出强大的分化潜力，尤其是在用RA和BDNF等联合剂处理时，但它们完全的功能成熟仍然具有挑战性。相比之下，IMR-32细胞表现出对RA诱导分化的部分抗性，并依赖其他化合物进行有效分化。理解方案中的变化如何影响这些细胞分化为不同神经元表型是至关重要的，最终，分化方法的选择应基于所需的神经元表型。
2.2.2 培养配置
认识到分化的神经母细胞瘤细胞系通常无法完全复制成熟神经元的形态、生化和功能特征，研究人员探索了不同的策略来增强分化结果。一种有前途的方法涉及在更复杂的神经生物学模型中培养这些细胞，例如更好地复制神经环境的3D系统，如先前对原代脑细胞培养所讨论的。为此目的，SH-SY5Y似乎是用于神经环境3D建模的唯一神经母细胞瘤细胞系。
在最近的一项研究中，研究人员表明，基于生长因子减少（GFR）的基质帮助SH-SY5Y细胞获得电活性胆碱能神经元的特征，能够建立具有活性突触结构和具有定向分选运输的囊泡的功能性网络。另一项研究利用细菌<
