《Molecular Plant Pathology》：Overexpression of Anthocyanidin Reductase Increases Flavonoids Content to Combat Fusarium Wilt in the Root Xylem of Vernicia montana
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本文研究发现，抗病树种油桐（Vernicia montana）根系木质部提取物能显著抑制致病菌Fusarium oxysporum f. sp. fordiis (Fof-1)的生长。通过多组学联合分析，揭示了Fof-1侵染后，抗病油桐中13种黄酮类物质含量显著增加，其中儿茶素（catechin）、(-)-表儿茶素（(-)-epicatechin）和(-)-表没食子儿茶素（(-)-epigallocatechin）具有明显抗菌活性。研究进一步鉴定出花青素还原酶基因（VmANR）是调控抗菌黄酮生物合成的关键基因，其过表达可显著提升黄酮含量，为培育抗枯萎病油桐品种提供了新策略。
引言：油桐枯萎病的威胁与抗病资源
由专化型镰刀菌Fusarium oxysporum f. sp. fordiis (Fof-1)引起的油桐枯萎病，是对油桐生产及桐油产业的严重威胁。油桐（Vernicia fordii）是我国重要的木本油料作物，其种子提取的桐油在工业、农业、军事和医药领域有广泛应用。该病在油桐生长盛期（5-7月）发生最为严重，主要侵害根系，导致主根和侧根腐烂，进而引起叶片萎蔫、整株逐渐死亡。自1939年在广西柳州首次发现以来，该病已蔓延至八个省份，造成毁灭性经济损失。
幸运的是，同属的中国特有树种木油桐（Vernicia montana）对Fof-1表现出高度的抗病性。利用木油桐作砧木、油桐作接穗进行嫁接可部分预防该病。因此，抗病的木油桐和感病的油桐为研究油桐抗枯萎病机制提供了理想材料。本研究通过比较分析，发现抗病木油桐根系木质部提取物对Fof-1生长具有显著抑制作用，进而从代谢物和基因层面深入探究其抗病机制。
根系木质部提取物对Fof-1生长的抑制作用
研究通过观察Fof-1在添加了木油桐和油桐根系木质部提取物的PDA平板上的生长情况，评估其抑菌差异。结果显示，木油桐的根系木质部提取物能强烈抑制Fof-1的分生孢子萌发和菌丝生长，而油桐的提取物则无明显抑制作用。接种第2天，木油桐提取物的抑制率达到最高值59.2%。在2至8天的观察期内，木油桐和油桐提取物的平均抑制率分别为52.4%和21.0%，表明木油桐根系木质部含有能有效抑制病原菌生长的活性物质。
Fof-1侵染后木油桐根系木质部黄酮类化合物的富集
为了鉴定潜在的抗病代谢物，研究人员对木油桐和油桐在Fof-1侵染四个时期（0、2、5、9天）的根系木质部进行了广泛的代谢谢组学分析。共检测到1921种次级代谢物。分析发现，有269种代谢物在木油桐的M2（5天）和M3（9天）时期含量增加，而在油桐中，这些代谢物的增加出现滞后，仅在F3（9天）时期才观察到。
KEGG富集分析表明，这269种差异代谢物显著富集于黄酮生物合成、淀粉和蔗糖代谢、半乳糖代谢、黄酮和黄酮醇生物合成以及维生素B6代谢等通路。其中，黄酮生物合成通路的富集显著性最高（p值最小）。在该通路中，共鉴定出18种代谢物，归属于13种黄酮类化合物：儿茶素、(-)-表儿茶素、(-)-表没食子儿茶素、二氢杨梅素、木犀草素、杨梅素、杨梅苷、根皮素、根皮苷、查尔酮柚皮素、柚皮素、紫铆花素和花旗松素。这13种黄酮在木油桐中的含量变化倍数显著高于油桐，其中柚皮素、(-)-表没食子儿茶素、花旗松素、查尔酮柚皮素和儿茶素的含量变化倍数均超过5倍，尤以柚皮素和(-)-表没食子儿茶素的变化最为剧烈。
儿茶素、(-)-表儿茶素和(-)-表没食子儿茶素在体外对Fof-1的抑制作用
针对上述13种黄酮类化合物，研究人员在体外评估了它们在不同浓度下对Fof-1的抗菌活性。结果表明，与溶剂对照（DMSO）和空白对照相比，只有(-)-表没食子儿茶素、儿茶素和(-)-表儿茶素能够抑制Fof-1的生长，其中(-)-表没食子儿茶素的抗菌活性最强。进一步的浓度梯度实验显示，在0.125和0.25 mg/mL浓度下，(-)-表儿茶素的抑制效果最明显；而当浓度超过0.5 mg/mL时，(-)-表没食子儿茶素的抑制效应最强。在4 mg/mL浓度下，(-)-表没食子儿茶素的抑制率达到最大值54.7%。这证实了这三种黄酮化合物是木油桐中重要的抗菌物质。
木油桐中黄酮生物合成通路相关基因的上调表达
转录组学分析为解析抗病机制提供了基因层面的证据。在木油桐和油桐的Fof-1侵染过程中，分别鉴定出3523个和7976个差异表达基因。维恩图分析显示，木油桐在三个比较组（M1 vs M0, M2 vs M0, M3 vs M0）中共同上调的基因有483个，而油桐中共同上调的基因有1956个。
KEGG富集分析发现，木油桐的483个共同上调基因显著富集于代谢通路、谷胱甘肽代谢、氰基氨基酸代谢、光合作用、多种植物次生代谢物生物合成、淀粉和蔗糖代谢、以及黄酮生物合成等通路。值得注意的是，黄酮生物合成通路在木油桐中也被显著富集，但在油桐中未被富集。在木油桐的黄酮生物合成通路中，有8个基因表达上调，包括花青素还原酶（ANR）、查尔酮黄烷酮异构酶（CHI）、咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶（CCoAMT）、细胞色素P450 75B1（CYP75B1）、蛋白SRG1-like和霜霉病抗性蛋白等基因。这些基因的表达模式与黄酮代谢物的积累趋势相一致，提示基因与代谢物在木油桐抗病响应中存在协同作用。
转录组与代谢谢组联合分析揭示黄酮生物合成通路中基因与代谢物的协同表达
整合分析显示，Fof-1侵染触发了木油桐的直接防御反应，包括黄酮类次生代谢物的产生和黄酮生物合成通路中基因表达的上调。具体而言，在木油桐中，(-)-表儿茶素、儿茶素、花旗松素、查尔酮柚皮素、二氢杨梅素、杨梅素和柚皮素等黄酮物质的丰度在M2时期急剧增加，并在M3时期维持在高水平。而在油桐中，这些黄酮仅在F3时期才出现增加。
与黄酮含量增加趋势相似，木油桐中黄酮生物合成通路的8个基因在Fof-1侵染后也呈现上调表达。其中，ANR（A008279, A008266）、CHI（A005627）和CYP75B1（A021985）这四个编码关键代谢酶的基因，参与了上述13种黄酮类物质的生物合成。鉴于抗菌实验结果表明(-)-表没食子儿茶素、儿茶素和(-)-表儿茶素对Fof-1生长具有明显抑制作用，而ANR（基因A008279和A008266）直接参与(-)-表儿茶素和(-)-表没食子儿茶素的生物合成，因此选择A008279和A008266进行深入分析和功能验证。
相关性分析表明，A008279和A008266的表达与大多数黄酮（如儿茶素、柚皮素、(-)-表儿茶素、查尔酮柚皮素、(-)-表没食子儿茶素、根皮苷、二氢杨梅素、根皮素和杨梅素）的丰度呈正相关。通过保守结构域分析，发现ANR基因A008266的保守结构域不完整，因此选择基因ANR A008279进行其抗病功能的验证。RT-qPCR分析证实，ANR（A008279）在木油桐Fof-1侵染的所有时期均上调表达，而在油桐中，该基因在F2时期下调，在F3时期才上调。这进一步支持了ANR在木油桐早期抗病响应中的重要作用。
ANR与黄酮生物合成中其他差异表达基因及代谢物的基因网络
利用加权基因共表达网络分析（WGCNA）方法，以权重截断值>0.40构建了基因与代谢物的调控网络。结果显示，ANR（A008279）与黄酮生物合成、苯丙烷生物合成、花青素生物合成和异黄酮生物合成通路中的39个边缘基因和44个边缘代谢物存在极高的连接性。共表达网络显示，上述13种黄酮类化合物中的9种被鉴定为边缘代谢物，包括儿茶素（n289T142, n289T156）、(-)-表儿茶素（p291T156）、(-)-表没食子儿茶素（n305T131, n305T54, n305T91）、二氢杨梅素（n319T177, p321T177）、木犀草素（p287T158, p287T214）、杨梅素（p319T186）、杨梅苷（n463T186）、根皮苷（n435T210）和柚皮素（p273T214）。这表明ANR（A008279）可能与参与黄酮生物合成的其他基因协同表达，产生不同的黄酮类物质以防御枯萎病。
过表达VmANR增加木油桐中黄酮的产量
为了探究木油桐中ANR基因（VmANR）表达水平的提高是否与黄酮含量相关，研究人员将其开放阅读框（ORF）扩增并插入过表达载体。由于木油桐是木本植物，缺乏高效的遗传转化体系，研究采用发根农杆菌介导的毛状根生成系统来验证VmANR的功能。以含有空载体的转基因毛状根作为对照，用对照或过表达VmANR（OE-VmANR）的载体对木油桐的根茎进行农杆菌转化。幼苗在相同条件下培养40天后，诱导出毛状根。
RT-qPCR验证筛选出对照组和OE-VmANR组的转基因阳性毛状根。通过高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）系统检测了WGCNA中涉及的9种黄酮物质。培养40天后，OE-VmANR组的基因表达量比对照组提高了约35倍。同样，HPLC-MS结果显示，OE-VmANR转基因毛状根中6种黄酮（儿茶素、(-)-表儿茶素、(-)-表没食子儿茶素、杨梅苷、根皮苷和柚皮素）的含量比对照组增加了6.5至12.1倍。二氢杨梅素和木犀草素的含量在OE-VmANR转基因毛状根中分别比对照组提高了约63.5倍和19.8倍。值得注意的是，杨梅素在OE-VmANR转基因毛状根和对照组中均未检测到。这表明引入的OE-VmANR激活了黄酮生物合成通路的代谢流，从而增强了木油桐中黄酮类物质的产量。
沉默VmANR降低木油桐中黄酮的产量
为了进一步验证VmANR在黄酮生物合成中的必要性，研究采用病毒诱导基因沉默（VIGS）方法在木油桐叶片中瞬时抑制其表达。将含有pTRV2-VmANR载体的根癌农杆菌导入木油桐叶片。18天后，RT-qPCR分析证实VmANR在VIGS植株叶片中的表达成功下调，而对照植株中的表达保持不变。同时，儿茶素和杨梅苷的含量分别比对照植株下降了9.5倍和1.5倍。值得注意的是，其他五种黄酮物质（(-)-表儿茶素、二氢杨梅素、(-)-表没食子儿茶素、木犀草素和杨梅素）在VIGS-VmANR植株叶片和对照组中均未检测到。这可能是由于木油桐的根组织含有更多种类和更高浓度的黄酮物质。该结果稳健地补充了先前的相关性分析，证明了VmANR表达与黄酮生物合成之间的因果关系，从而巩固了其在调控木油桐黄酮多样性中的核心作用。
VmANR具有以花青素为底物催化产生(-)-表没食子儿茶素的酶活性
ANR是原花青素生物合成中的关键酶。研究表明，拟南芥和中蒺藜苜蓿的ANR在体外能将花青素转化为(-)-表儿茶素（以及儿茶素），并能将飞燕草素转化为等量的(-)-没食子儿茶素和(-)-表没食子儿茶素。本研究进一步探索了VmANR在调控黄酮代谢物积累中的功能。将VmANR的ORF克隆到表达载体pET-32a中，在其N端添加6×His标签，并在大肠杆菌BL21中表达。纯化His-VmANR融合蛋白，并在体外测试其对市售花青素和飞燕草素的活性。
通过HPLC分析，检测His-VmANR催化反应中的产物，包括(-)-表儿茶素、儿茶素、(-)-没食子儿茶素、(-)-表没食子儿茶素。HPLC数据显示，VmANR有一种新的催化反应，即催化底物花青素形成(-)-表没食子儿茶素。而当底物为飞燕草素时，未检测到上述四种产物。研究人员推测，VmANR在体外持续催化花青素生成(-)-表没食子儿茶素，而(-)-表没食子儿茶素和儿茶素作为中间产物未被检测到。据所知，这是首次报道从花青素形成(-)-表没食子儿茶素。此外，在体内OE-VmANR转基因毛状根中，(-)-表没食子儿茶素的含量比对照增加了6.5倍。
讨论与结论
本研究揭示了抗病木油桐根系木质部提取物对Fof-1的生长具有显著抑制作用。Fof-1是一种土传维管束病原菌，最初通过根系感染油桐，然后进入木质部导管增殖，阻碍水分和矿物质的运输。植物的木质部导管能够积累不同的次生代谢物以防御病原体入侵。本研究通过联合转录组和代谢谢组分析，筛选出木油桐在Fof-1侵染后黄酮生物合成通路中增加的13种黄酮类和8个上调表达的基因。过表达VmANR提高了黄酮含量，其中儿茶素、(-)-表儿茶素和(-)-表没食子儿茶素对Fof-1生长表现出明显的抑制作用。酶活实验进一步验证了VmANR在体外能催化花青素形成(-)-表没食子儿茶素。
综上所述，本研究确定了VmANR是促进抗菌黄酮生物合成以形成对Fof-1侵染抗性的关键基因，从而为培育抗镰刀菌枯萎病的油桐树种提供了策略。该研究首次证实了过表达VmANR能赋予木油桐对Fof-1侵染的抗性，并首次报道了ANR催化花青素形成(-)-表没食子儿茶素这一新的酶学功能。
