《Molecular Plant Pathology》：Transcription Factor PFB1 Is Required for the Botrytis cinerea Effector BcSCR1-Mediated Pathogenesis
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本研究揭示了灰葡萄孢（Botrytis cinerea）分泌的新型效应蛋白BcSCR1通过直接结合拟南芥转录因子PFB1，抑制其转录激活活性，进而下调植物免疫关键基因OPR3和WRKY33的表达，最终促进病原菌侵染的分子通路。该发现为解析坏死营养型真菌的致病机制提供了新视角，对开发作物抗病策略具有重要指导意义。
1 引言
灰葡萄孢（Botrytis cinerea）作为一种坏死营养型真菌，能够侵染超过1400种植物，在全球范围内造成严重的采前和采后灰霉病损失。其侵染过程包括早期局部坏死斑的形成和后期病斑快速扩展两个阶段。病原菌通过分泌效应蛋白和植物毒性特殊代谢物来克服植物免疫，其中效应蛋白在抑制宿主防御反应中起关键作用。然而，关于灰葡萄孢效应蛋白的分子功能及其作用机制仍知之甚少。本研究旨在鉴定灰葡萄孢的新型效应蛋白，并解析其通过靶向植物转录因子调控免疫反应的分子机制。
2 结果
2.1 灰葡萄孢与拟南芥互作蛋白的鉴定
通过生物信息学分析，从灰葡萄孢130,703个蛋白质中筛选出1093个含有N端信号肽的蛋白，进一步剔除跨膜结构域后获得851个候选蛋白。利用WoLF PSORT软件预测亚细胞定位，最终选定541个蛋白进行后续分析。通过BLASTP比对，筛选出34个候选效应蛋白构建酵母双杂交诱饵载体。同时，从植物抗病基因数据库（PRGdb）中选取21个拟南芥抗病（R）蛋白构建猎物载体。采用基于重组的库对库高通量酵母双杂交（RLL-Y2H）筛选技术，共获得157个阳性克隆，测序鉴定出6对潜在互作关系。其中，BCIN_13g00380与转录因子PFB1的互作频率最高，被选作后续研究对象。
2.2 BcSCR1与转录因子PFB1的物理互作
BCIN_13g00380被命名为灰葡萄孢小半胱氨酸富集蛋白1（BcSCR1），其含有预测的N端信号肽（1–20位氨基酸）和122个氨基酸残基，其中包括6个高度保守的半胱氨酸残基。系统发育分析显示BcSCR1在葡萄孢属（Botryotinia）和核盘菌属（Sclerotinia）中具有高度序列保守性。一对一酵母双杂交实验证实BcSCR1与PFB1存在互作。GST pull-down实验显示His标签的BcSCR1能被GST标签的PFB1拉下，而非GST标签对照。亚细胞定位表明，带有信号肽的SP-BcSCR1、不带信号肽的BcSCR1以及PFB1均定位于细胞核和细胞质。在本氏烟叶片中共表达BcSCR1-mCherry和PFB1-GFP，发现两者在细胞核和细胞质中部分共定位。双分子荧光互补（BiFC）实验显示，当BcSCR1-YFPN和PFB1-YFPC在本氏烟叶片中共表达时，在细胞核中检测到重建的YFP荧光。拆分荧光素酶互补成像（LCI）实验进一步验证了PFB1-nLUC和BcSCR1-cLUC共表达时能重建荧光素酶活性。此外，免疫共沉淀（Co-IP）实验证实PFB1-GFP与BcSCR1-mCherry在植物细胞内存在互作。
2.3 BcSCR1是灰葡萄孢的分泌蛋白并可转运至宿主细胞
构建表达BcSCR1-GFP融合蛋白的工程菌株B05.10-SCR1-GFP，荧光显微镜观察发现BcSCR1-GFP定位于菌丝表面。RT-qPCR分析显示B05.10-SCR1-GFP中BcSCR1转录水平显著高于野生型。Western blotting检测到培养液上清中存在BcSCR1-GFP蛋白，证实BcSCR1为分泌蛋白。将B05.10-SCR1-GFP分生孢子接种于洋葱内表皮，36小时后在宿主细胞的细胞质、细胞壁和细胞核中检测到绿色荧光信号，表明BcSCR1可转运至宿主细胞内。
2.4 BcSCR1作为效应蛋白促进灰葡萄孢侵染
通过同源重组构建BcSCR1缺失突变体（ΔBcSCR1）。RT-qPCR证实突变体中BcSCR1转录本几乎无法检测。在PDA平板上，ΔBcSCR1的菌落形态与野生型无显著差异，但径向生长略有减缓。培养7天后，ΔBcSCR1的分生孢子产量显著低于野生型。接种拟南芥离体叶片2天后，ΔBcSCR1引起的病斑直径显著小于野生型。qPCR检测病原菌生物量显示，ΔBcSCR1在Col-0植物中的定殖量低于野生型。类似表型在本氏烟叶片中也被观察到。RT-qPCR分析防御相关基因表达发现，接种ΔBcSCR1孢子后，PDF1.2和OPR3的表达水平显著低于野生型接种。
为研究BcSCR1对植物免疫反应的功能影响，构建了异位表达BcSCR1的拟南芥株系。结果显示，BcSCR1过表达植株对B05.10感染更敏感，病斑尺寸更大。台盼蓝染色和电解质渗漏率进一步证实了这一结果。此外，BcSCR1过表达植株中防御标志基因（如LOX3、OPR3和WRKY33）的表达水平显著下调。
2.5 PFB1负调控植物对灰葡萄孢的抗性
从ABRC获得两个PFB1T-DNA插入突变体pfb1-1和pfb1-2。根长实验表明突变体根系短于Col-0。启动子驱动GUS报告基因（pPFB1::GUS）的组织化学染色显示PFB1在叶片、花瓣和豆荚中表达，茉莉酸甲酯（MeJA）处理下调根和叶片中PFB1表达。PFB1表达受MeJA抑制，但受灰葡萄孢感染诱导。接种B05.10后，pfb1突变体病斑面积显著小于Col-0。台盼蓝染色和电解质渗漏数据证实PFB1功能缺失增强植物对灰葡萄孢的抗性。
为验证表型特异性，构建了PFB1回补株系，其病斑面积与Col-0无差异。过表达PFB1（OE-PFB1）植株接种B05.10后坏死症状更严重，病斑更大。防御标志基因（LOX3、NPR1、PAD4和PFD1.2）在pfb1突变体中上调，在OE-PFB1植株中下调。
2.6 BcSCR1靶向PFB1促进病原菌侵染
在本氏烟叶片中瞬时表达不同组合载体并接种ΔBcSCR1，发现表达BcSCR1可恢复ΔBcSCR1的侵染力，病斑显著大于表达mCherry的对照。共表达BcSCR1和PFB1的叶片病斑大于共表达PFB1和mCherry的叶片。用纯化的His标签BcSCR1蛋白浸润Col-0和pfb1-1叶片后接种ΔBcSCR1孢子，发现Col-0中BcSCR1处理组病斑大于PBS或His蛋白对照组，而pfb1-1突变体中无显著差异。
2.7 BcSCR1与PFB1互作抑制OPR3和WRKY33表达
茉莉酸（JA）在激活抗真菌防御反应中起核心作用。OPR3是JA生物合成关键基因，WRKY33通过调控JA信号参与拟南芥对灰葡萄孢的抗性。本研究发现在正常条件下，PFB1过表达株系中OPR3和WRKY33表达下调，pfb1突变体中上调。双荧光素酶报告实验显示，表达PFB1显著提高由pOPR3或pWRKY33驱动的荧光素酶活性，而共表达BcSCR1和PFB1抑制此活性。荧光素酶成像进一步证实PFB1促进OPR3和WRKY33转录，BcSCR1抑制PFB1的转录激活功能。
启动子分析发现OPR3和WRKY33启动子含有4个E-box（CANNTG） motif，可能是PFB1结合位点。染色质免疫共沉淀-qPCR（ChIP-qPCR）显示，在OE-PFB1植株中，B05.10感染后PFB1与pOPR3的p2区域和pWRKY33的p1区域结合显著减少，而ΔBcSCR1感染后结合恢复。电泳迁移率变动分析（EMSA）证实PFB1蛋白直接结合pOPR3p2区域和pWRKY33p1区域。
3 讨论
本研究鉴定出灰葡萄孢新型效应蛋白BcSCR1，其通过靶向拟南芥转录因子PFB1抑制植物免疫。BcSCR1定位于宿主细胞核和细胞质，异位表达直接抑制防御相关基因表达。PFB1参与植物生长发育调控，正常条件下直接激活OPR3和WRKY33表达。灰葡萄孢侵染时分泌BcSCR1，后者进入细胞核与PFB1互作，抑制其转录活性，导致OPR3和WRKY33下调，从而削弱JA介导的防御反应。
PFB1功能缺失增强植物抗病性，提示其他转录因子（如ERF1、C3H14）可能通过上调PDF1.2或WRKY33表达补偿PFB1功能。灰葡萄孢通过操纵JA信号反馈抑制PFB1转录，形成病原菌-宿主反馈环路。该研究揭示了坏死营养型真菌通过效应蛋白靶寄主转录因子重编程免疫信号的新机制，为作物抗病育种提供潜在靶点。
4 实验方法
真菌菌株于PDA平板或PDB液体培养基22°C培养。拟南芥植株在短日照（8小时光照/16小时黑暗）、本氏烟在长日照（16小时光照/8小时黑暗）条件下22°C培养。采用农杆菌介导的转化法生成转基因植株和真菌突变体。蛋白互作通过Y2H、GST pull-down、BiFC、LCI和Co-IP验证。基因表达通过RT-qPCR分析。ChIP-qPCR和EMSA用于检测转录因子与启动子结合。双荧光素酶报告系统评估转录激活活性。数据统计采用Student's t检验或单因素ANOVA。
