《Cell Death Discovery》：FDX1-mediated cuproptosis promotes cholestatic liver injury exacerbated by taurocholic acid-enhanced copper accumulation
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本研究针对胆汁淤积性肝损伤中铜超载的致病机制，通过临床队列分析、动物模型和细胞实验，首次揭示taurocholic acid（TCA）通过增强肝细胞铜蓄积加剧FDX1介导的铜死亡（cuproptosis）过程。研究发现铜螯合剂tetrathiomolybdate（TTM）和smoothened激动剂（SAG）能有效缓解肝损伤，为临床治疗提供了新靶点。该成果发表于《Cell Death Discovery》，为胆汁淤积性肝损伤的发病机制提供了全新视角。
当我们谈论肝脏疾病时，胆汁淤积性肝损伤是一个不容忽视的严重问题。这种疾病主要表现为肝细胞长期暴露在高浓度胆汁成分中，是多种肝胆疾病的共同病理特征。尽管现有治疗方法不断进步，但患者长期生存仍面临严峻挑战。有趣的是，作为人体铜排泄的主要途径，胆汁淤积是否会通过铜代谢紊乱参与肝损伤的发生？这个科学问题一直悬而未决。
近日发表在《Cell Death Discovery》杂志上的一项研究，为我们揭开了这个谜题的神秘面纱。研究人员通过系统的实验设计，首次阐明了铜超载在胆汁淤积性肝损伤中的关键作用，并发现了一种名为taurocholic acid（TCA）的胆汁酸成分能够加剧这一过程。
为了回答这些科学问题，研究团队运用了多种先进的技术方法：首先开展了包含80,519例儿科患者的回顾性临床研究，分析血清铜水平与胆汁淤积标志物的相关性；其次利用胆管结扎（BDL）大鼠模型模拟胆汁淤积条件，并通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析胆道闭锁（BA）患者肝组织；在细胞水平上，采用大鼠BRL 3A和小鼠AML12肝细胞系建立铜超载模型，通过RNA测序进行转录组分析；同时使用蛋白质印迹（Western blot）、免疫荧光和代谢通量分析等技术评估铜死亡相关标志物的表达和功能变化。
Elevated serum copper levels in children with cholestasis
研究团队首先对80,519名儿科患者的临床数据进行了回顾性分析。结果显示，与γ-谷氨酰转移酶（GGT）正常组相比，GGT升高组的血清铜水平显著上升（16.3 μmol/L vs. 15.7 μmol/L），同时伴有丙氨酸氨基转移酶（ALT）、直接胆红素（DBIL）和总胆汁酸（TBA）的升高。这一发现提示铜代谢紊乱可能是胆汁淤积性肝损伤的一个新特征。
ScRNA-seq analysis reveals decreased FDX1 expression in hepatocytes of pediatric cholestasis patients
通过对胆道闭锁（BA）患者的肝组织进行单细胞RNA测序分析，研究人员发现BA来源的肝细胞中FDX1（ferredoxin 1）表达显著下调。FDX1作为铜死亡的关键调控因子，其表达下降提示铜死亡可能参与了胆汁淤积性肝损伤的发病过程。
Obstructive cholestasis induces dysregulated copper homeostasis with concomitant liver injury and cuproptotic changes in rats
在胆管结扎（BDL）大鼠模型中，研究人员观察到血清和肝组织铜水平显著升高，同时伴有肝损伤标志物（GGT、ALT、AST）和TBA的上升。组织学分析显示BDL大鼠出现明显的胆管周围纤维化和肝实质铜沉积。蛋白质印迹结果进一步证实，铜死亡相关标志物DLAT（dihydrolipoamide S-acetyltransferase）、DLST（dihydrolipoamide S-succinyltransferase）、LIAS（lipoic acid synthetase）和FDX1的表达均出现下调，这与铜死亡的特征性调控模式相符。
High copper intake exacerbates BDL-induced liver injury and fibrogenesis, while TTM ameliorates hepatic pathology in rat
为了进一步验证铜在胆汁淤积性肝损伤中的致病作用，研究人员设置了三个实验组：正常饮食组（BDL+ND）、高铜饮食组（BDL+HCD）和铜螯合剂tetrathiomolybdate（TTM）治疗组（BDL+TTM）。结果显示，高铜饮食显著加剧了BDL引起的肝损伤、胆管周围纤维化和铜沉积，而TTM治疗则有效缓解了这些病理变化。Western blot分析进一步证实，高铜饮食诱导的铜死亡调控因子FDX1、DLAT、DLST和LIAS的下调均被TTM处理所改善。
Copper chloride and copper ionophore trigger cuproptosis in rat hepatocytes via copper overload-dependent pathways
在体外实验中，研究人员使用CuCl2和铜离子载体elesclomol（ES）处理大鼠BRL 3A肝细胞，模拟胆汁淤积肝脏中铜超载的肝细胞。结果显示，CuCl2和ES以浓度依赖性的方式降低细胞活力，并诱导细胞内铜积累。Western blot分析显示铜死亡相关蛋白（DLAT、脂酰化DLAT、DLST、LIAS、FDX1）表达显著下调，同时DLAT单体减少而寡聚化形式增加。免疫荧光证实DLAT的线粒体定位，且表达降低、寡聚化增加。代谢分析显示三羧酸循环功能受损，氧消耗率（OCR）测定表明基础呼吸、最大呼吸和ATP产生均显著降低。
Taurocholic acid exacerbates CuCl2- and copper ionophore-induced cell death via enhanced copper accumulation
研究人员进一步探讨了胆汁酸对铜诱导肝细胞死亡的影响。结果显示，taurocholic acid（TCA）显著加剧了Cu/ES诱导的细胞活力下降，这一效应被TTM处理所减弱。值得注意的是，TCA干预进一步下调了铜死亡标志物的蛋白水平，并增强了细胞内铜水平和细胞铜积累。这些发现表明TCA通过促进细胞铜积累来增强Cu/ES诱导的肝细胞铜死亡。
Smoothened signaling suppression mediates copper-induced hepatocyte death
通过RNA测序分析，研究人员发现Cu/ES处理的细胞出现了显著的转录组重编程，而TCA联合处理则进一步加剧了这种变化。基因本体（GO）富集分析显示，Cu/ES处理细胞中下调的基因显著富集在smoothened信号通路（GO:0007224）。实验验证表明，smoothened激动剂（SAG）处理显著改善了细胞毒性效应，逆转了铜诱导的DLAT下调，恢复了SMO及其下游调控因子GLI1和GLI2的表达。
1 and q value<0.05), showing the top 10 enriched biological processes(D,E).F,G BRL 3A cells were treated with SAG, or treated with SAG/CuCl2(150μM)/ES(40 nM), or treated with SAG/CuCl2(300μM)/ES(40 nM) in SAG concentration gradients(0-4.5μM) for 24 h. Line plots of CCK-8 assay for fold cell viability, relative to control group(F; n=3), and RT-qPCR of SMO,GLI1 and GLI2, normalized to the control group(G;n=3).H Western blot of DLAT,LIAS,FDX1 and SMO after BRL 3A cells were treated with CuCl2(150μM) and ES(40 nM) in combination with SAG(2.5μM) for 24 h. Right: fold change in protein expression relative to control group. Data are mean±SD. One-way ANOVA with Sidak's correction(F) and two-way ANOVA with Sidak's correction G,H Abbreviations: PCA principal component analysis,DEGs differentially expressed genes, FPKM fragments per kilobase million, SAG smoothened agonist.'>
FDX1 plays a complex regulatory role in hepatocyte cuproptosis
通过功能获得和功能丧失实验，研究人员发现FDX1在肝细胞铜死亡中扮演复杂调控角色。有趣的是，FDX1敲低对细胞活力没有显著影响，而FDX1过表达则显著增强了肝细胞对铜死亡的抵抗能力。机制上，FDX1过表达在铜超载条件下上调了DLAT、LIAS和脂酰化DLAT的蛋白表达，这可能是表型观察的分子基础。
这项研究的重要意义在于首次建立了FDX1介导的taurocholic acid加剧铜死亡与胆汁淤积诱导的肝毒性之间的直接联系。研究发现不仅揭示了铜超载诱导的铜死亡在胆汁淤积性肝损伤中的关键作用，还发现了TCA通过增强细胞铜积累而加剧这一过程的新机制。更为重要的是，研究确定了smoothened信号通路在铜死亡中的调控作用，并验证了TTM和SAG作为治疗胆汁淤积性肝损伤的潜在候选药物。
这项研究的发现为理解胆汁淤积性肝损伤的分子机制提供了全新视角，也为开发针对铜死亡通路的新型治疗策略奠定了理论基础。未来针对FDX1和smoothened信号通路的深入研究，可能为胆汁淤积性肝损伤患者带来新的希望。
