《Communications Biology》：Stevioside curbs Streptococcus pneumoniae infection via inhibiting capsule biosynthesis
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本研究针对肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)因荚膜导致的抗生素耐药和非疫苗血清型感染难题，发现天然化合物甜菊苷(stevioside)能有效抑制荚膜多糖(CPS)合成。机制研究表明，甜菊苷通过干扰细菌丙酮酸代谢，破坏NAD+/NADH氧化还原平衡和能量生成，从而削弱荚膜介导的免疫逃逸和应激耐受。体内外实验证实，甜菊苷能显著增强宿主免疫清除能力，为研发抗毒力药物提供了新思路。
肺炎链球菌(S. pneumoniae)作为一种常见的呼吸道致病菌，是全球范围内导致儿童和老年人高发病率及死亡率的主要原因之一。尽管肺炎链球菌结合疫苗(PCVs)已在全球广泛接种，但由于抗生素耐药性问题日益严重以及疫苗血清型覆盖范围的局限性，肺炎链球菌感染依然是一个严峻的公共卫生挑战。这种细菌的致病性高度依赖于其最外层的荚膜多糖(Capsular Polysaccharide, CPS)结构。荚膜犹如细菌的“隐形斗篷”，能帮助细菌逃避宿主补体系统的攻击、抵抗抗菌肽(Antimicrobial Peptides, AMPs)的杀伤、阻碍吞噬细胞的吞噬作用，并降低其对上皮细胞的黏附，从而促进细菌的播散。鉴于荚膜在肺炎链球菌致病过程中的核心作用，它成为一个极具吸引力的药物靶点。研发针对荚膜而非直接杀死细菌的抗毒力药物(Anti-virulence drugs)，有望成为对抗耐药菌感染和应对疫苗血清型缺口的一种替代策略。
在此背景下，发表于《Communications Biology》的一项研究，由顾三伟、张健等研究人员完成，他们从包含800种化合物的小分子库中筛选出一种有潜力的荚膜抑制剂——甜菊苷(Stevioside)。这是一种从甜叶菊(Stevia rebaudiana)中提取的天然有机分子。研究人员开展了一系列实验，探究甜菊苷是否能有效抑制肺炎链球菌荚膜的生物合成，并阐明其作用机制，最终评估其在体内外对抗感染的有效性。
为开展研究，作者团队运用了多项关键技术方法，包括：基于LC-MS（液相色谱-质谱联用）的非靶向代谢组学分析，用于探究甜菊苷对细菌整体代谢谱的影响；通过尿酸测定法和酚硫酸法定量分析荚膜多糖产量；采用FITC-葡聚糖排除实验和透射电子显微镜(Transmission Electron Microscopy, TEM)直观观察和测量荚膜厚度与形态；通过定量检测细胞内丙酮酸水平、NAD+/NADH比值和ATP水平来评估细菌能量代谢状态；利用时间杀伤曲线法评估甜菊苷对LL-37和粘菌素抗菌活性的增敏作用；通过免疫荧光法分析补体成分C3b/iC3b和膜攻击复合物C5b-9在菌体表面的沉积情况；利用细胞模型（A549肺上皮细胞、RAW 264.7巨噬细胞系和小鼠原代腹膜巨噬细胞）进行细菌黏附和吞噬实验；并最终利用大蜡螟(Galleria mellonella)幼虫感染模型和小鼠肺炎模型评价甜菊苷的体内保护效果。
甜菊苷抑制肺炎链球菌荚膜多糖合成而不影响细菌活力
研究首先证实，甜菊苷在有效浓度范围内对肺炎链球菌标准株D39的生长没有抑制作用。通过尿酸测定和酚硫酸法分析发现，甜菊苷能剂量依赖性地减少荚膜多糖的产量。FITC-葡聚糖排除实验直观显示，甜菊苷处理导致细菌周围的荚膜厚度显著减小。透射电镜观察进一步提供了确凿证据：甜菊苷处理后的D39链球菌，其表面的多糖荚膜在数量和密度上均明显减少，荚膜链长变短，且出现异质性和稀疏的颗粒结构。重要的是，这种抑制作用在不同培养基条件下均能发生，并且对多种血清型（1型、6A型、22F型、5型和6B型）的肺炎链球菌均有效，表明甜菊苷可能是一种广谱的肺炎链球菌荚膜抑制剂。
甜菊苷通过降低丙酮酸积累及破坏细菌NAD+/NADH氧化还原平衡和能量生成来抑制荚膜产生
为了探究甜菊苷抑制荚膜合成的机制，研究人员进行了非靶向代谢组学分析。偏最小二乘判别分析(PLS-DA)显示，甜菊苷处理组的细菌代谢谱与对照组显著分离。他们鉴定出202种差异代谢物，KEGG通路富集分析显示，这些代谢物显著富集于氨基酸代谢、辅因子和维生素代谢等通路。网络分析进一步揭示，丙酮酸是连接这些富集通路的核心代谢物，且其水平在甜菊苷处理后显著降低。定量分析证实，甜菊苷剂量依赖性地降低了细菌内的丙酮酸浓度。由于丙酮酸代谢对于维持NAD+/NADH平衡和稳定的能量产生至关重要，研究人员进一步检测了这些指标。结果显示，甜菊苷处理虽未改变总NAD(H)池的大小，但导致NADH水平下降，从而使NAD+/NADH比值显著升高，同时细胞内ATP水平也呈剂量依赖性降低。补充外源性丙酮酸或使用缺乏丙酮酸氧化酶SpxB的突变株进行实验，部分逆转了甜菊苷对荚膜的抑制作用，并缓解了ATP的消耗，这表明甜菊苷通过干扰丙酮酸代谢影响能量状态，进而抑制荚膜合成。此外，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示，甜菊苷并未显著影响荚膜合成关键基因（cpsA, cpsC, cpsD, cpsE）的转录水平，提示其作用可能发生在转录后或翻译水平，主要通过对代谢通路的调控来实现。
甜菊苷逆转了荚膜介导的肺炎链球菌应激耐受性
位于荚膜菌最外层的多糖荚膜有助于肺炎链球菌在致命酸性条件（如溶酶体降解和胃肠道应激）下存活，并保护细菌免受活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)的杀伤。如所推测，甜菊苷显著削弱了荚膜介导的酸休克抵抗能力，在处理组的整个测试期间，细菌生长速率均较低。此外，与对照组相比，经甜菊苷处理的细菌在体外对H2O2介导的杀伤作用更为敏感。这些结果表明，甜菊苷通过抑制荚膜，使肺炎链球菌对有害应激源（至少包括酸休克和氧化应激）更加敏感。
甜菊苷减弱了荚膜赋予的对抗菌肽杀伤作用的保护
宿主抗菌肽（如cathelicidin肽LL-37）在抵御细菌入侵的第一道先天免疫防线中扮演着不可或缺的角色。位于细菌表面的荚膜多糖可以通过充当“诱饵”减少到达细菌表面的肽量，从而保护细菌免受抗菌肽的杀伤。与荚膜厚度明显减少的结果一致，甜菊苷有效降低了荚膜赋予的肺炎链球菌对LL-37杀伤的抵抗力，且呈剂量依赖性。值得注意的是，先前研究认识到多粘菌素（一种肽类相关抗菌药）与LL-37具有相似的细菌结合机制和耐药策略。尽管甜菊苷并未降低多粘菌素对D39肺炎链球菌的最低抑菌浓度(MIC)，但在时间杀伤实验中，它显著降低了细菌的存活率。这些结果证明，甜菊苷可以通过抑制荚膜相关的抗菌肽耐药性，部分促进细菌清除。
甜菊苷增加了C3b/iC3b和C5b-9膜攻击复合物在肺炎链球菌表面的沉积
补体系统是宿主免疫系统的关键组成部分，是抵御肺炎链球菌入侵的另一道重要先天防线。荚膜能阻止补体沉积。由于所有补体途径的激活都会触发C3b的产生及其与细菌表面的结合，以及随后的C5b-9膜攻击复合物(MACs)的形成，研究人员进一步检测了这些补体成分在细菌表面的沉积。免疫荧光分析显示，与对照组相比，甜菊苷处理显著增加了菌体表面的C3b/iC3b沉积水平。一致地，在甜菊苷处理组中也观察到C5b-9结合量的大幅增加。这些结果表明，甜菊苷通过抑制荚膜，促进了补体激活，从而可能加速宿主免疫系统对肺炎链球菌的清除。
甜菊苷通过抑制荚膜阻碍肺炎链球菌的免疫逃逸
荚膜在肺炎链球菌感染期间的免疫逃逸中也发挥着不可或缺的作用。带负电的多糖荚膜不仅通过阻碍细菌与上皮细胞的黏附来促进细菌播散，还通过阻断吞噬作用和后续的宿主免疫细胞反应来保护细菌免受免疫清除。因此，研究人员分别使用A549细胞进行了黏附实验，并使用小鼠腹膜巨噬细胞(MPMs)和RAW 264.7细胞进行了吞噬实验。如所推测，甜菊苷剂量依赖性地增加了附着在A549细胞上的细菌数量。尽管吞噬实验是在无补体条件下进行的，但结果显示，在MPMs中，16μg/ml的甜菊苷即可显著提高细胞内细菌的比例；而在RAW 264.7细胞中，64μg/ml的甜菊苷也显示出促进作用，这表明不同细胞系的吞噬能力存在差异。吉姆萨染色后的RAW 264.7细胞显微镜观察也显示，与对照组相比，甜菊苷处理细胞内有更多可见且可计数的被吞噬的细菌。基于这些结果，研究人员推测甜菊苷也可能通过增加补体激活和细菌被吞噬，来改善中性粒细胞对肺炎链球菌的调理吞噬作用。
甜菊苷拯救了感染肺炎链球菌的大蜡螟
为了初步探究甜菊苷在体内对肺炎链球菌感染的影响，研究人员首先进行了大蜡螟致死实验。接种1×106个D39肺炎链球菌导致幼虫在36小时内死亡率达90%。令人鼓舞的是，使用50 mg/kg的甜菊苷治疗将死亡率从90%降低至50%，存活率显著提高了40%。且单用甜菊苷而不感染不会导致死亡，证实该化合物在体内安全无毒。在感染后6小时，处死幼虫并检测血腔中的细菌负荷，发现甜菊苷治疗组幼虫血腔中的细菌载量远低于对照组，表明在甜菊苷治疗下，宿主防御系统实现了更强的细菌清除能力。黑化程度（与昆虫先天免疫系统反应及病原体负荷相关）在甜菊苷治疗组中也显著减轻。这些结果证明，甜菊苷通过抑制荚膜赋予的致病性，有效保护了大蜡螟免受肺炎链球菌感染。
甜菊苷在小鼠体内对肺炎链球菌感染提供了有效保护
随后，研究人员进一步使用小鼠模型评估了甜菊苷在致命性肺炎链球菌肺炎中的体内治疗效果。如预期，每天三次皮下注射50 mg/kg甜菊苷能有效保护小鼠免受感染，延迟死亡时间，并使存活率较溶剂对照组提高44.44%。所有存活小鼠在停药后均保持存活且状态良好。相应地，甜菊苷治疗组小鼠肺组织中的平均细菌载量比对照组低约10倍。同时，病理学观察显示，接种亚致死量肺炎链球菌的对照组小鼠肺部出现明显的暗红色病变伴血液外渗，组织病理学评估显示明显的支气管肺炎特征，包括严重水肿、充血和中性粒细胞浸润。相比之下，甜菊苷治疗大大改善了大体病变和组织病理学损伤。与病理切片观察到的受限的气道炎症一致，甜菊苷治疗也显著降低了肺组织匀浆中炎症细胞因子IL-6和IL-1β的水平。为了使治疗实验更接近实际应用，研究人员进一步评估了每天一次皮下注射150 mg/kg甜菊苷的治疗效果。该治疗方案同样显著提高了小鼠的存活率，表明该化合物在临床实践中具有广阔前景。
研究结论与意义
本研究成功鉴定出天然化合物甜菊苷作为一种有效的肺炎链球菌荚膜抑制剂，其通过改变丙酮酸代谢，破坏细菌NAD+/NADH氧化还原平衡和能量生成，从而抑制荚膜多糖的生物合成。作为一种抗毒力策略，甜菊苷本身不直接杀死细菌，而是通过“解除”细菌的关键毒力武器——荚膜，来削弱其致病力。这显著减弱了荚膜在肺炎链球菌感染中的核心免疫逃逸作用，使细菌更易遭受宿主抗菌肽杀伤、补体系统攻击、吞噬细胞清除以及各种环境应激（如酸性和氧化应激）的影响，最终促进了有效的宿主免疫清除。
该研究的发现具有重要意义：首先，它为解决肺炎链球菌，特别是耐药菌和非疫苗血清型感染问题，提供了一种全新的、有别于传统抗生素和疫苗的干预策略。其次，研究揭示了靶向细菌代谢通路（尤其是丙酮酸代谢）来调控毒力因子合成的新机制，为后续开发针对其他病原体的抗毒力药物提供了新思路。最后，甜菊苷作为一种天然产物，具有较好的安全性基础，为其进一步的临床前和临床开发奠定了良好基础。总之，这项研究为开发荚膜靶向治疗策略以及利用甜菊苷这一有前景的候选化合物来应对肺炎链球菌感染铺平了道路。
