基于Ti3C2TxMXene/酶功能化纳米传感器实现活体神经元及类器官单囊泡乙酰胆碱存储与亚量子释放的动态监测

《ANGEWANDTE CHEMIE-INTERNATIONAL EDITION》：A Novel Acetylcholine Nanosensor for Single Vesicle Storage and Sub-Quantal Exocytosis in Living Neurons and Organoids

本研究开发了一种Ti3C2TxMXene/酶功能化（M@E@CF）纳米传感器，首次在单个囊泡水平实现了乙酰胆碱（ACh）存储与释放的动态量化。该平台结合胞内囊泡冲击电化学计数法（IVIEC）和单细胞安培法（SCA），在小鼠源性胆碱能神经元及人脊髓类器官中均证实了ACh的亚量子释放模式。通过一维卷积神经网络（1D-CNN）对胞吐峰值形态进行智能分类，揭示了不同释放模式的动力学差异。在唐氏综合征（DS）模型中，发现囊泡ACh存储与释放量显著降低，但释放比例反而升高，且融合孔持续时间缩短。该技术为胆碱能系统生理功能与病理机制研究提供了关键工具。

　　

研究背景与意义

乙酰胆碱（ACh）作为中枢及周围神经系统中的关键神经递质，参与调节认知、学习记忆及骨骼肌收缩等多种生理功能。其囊泡存储与释放动力学与胆碱能信号传递密切相关，细微改变可能导致唐氏综合征（DS）、阿尔茨海默病（AD）等神经功能障碍。然而，由于ACh不具备电化学活性，且传统检测技术难以同时满足微秒级时间分辨率与单细胞空间精度的要求，在体定量分析单囊泡ACh存储与释放动力学一直面临重大技术挑战。

M@E@CF纳米传感器的构建与表征

研究团队通过3D打印定制反应模具，依次在碳纤维纳米尖端微电极上修饰Ti₃C₂T_xMXene（提升电化学表面积与电子转移效率）、固定乙酰胆碱酯酶（AChE）与胆碱氧化酶（ChO），并覆盖Nafion保护层，构建了M@E@CF纳米传感器。该传感器通过双酶级联反应将ACh转化为电活性过氧化氢（H₂O₂）进行检测。线性校准实验显示，传感器对14–800 mM浓度范围的ACh负载囊泡具有良好线性响应（R²=0.9766），且对脑内常见干扰物具有高选择性。

单囊泡ACh存储的定量分析

利用胞内囊泡冲击电化学计数法（IVIEC），将M@E@CF纳米传感器插入小鼠内侧节隆起（MGE）来源的胆碱能神经元胞体，成功记录到单个囊泡内ACh释放产生的电流峰。通过胆碱转运体抑制剂（HC-3）处理验证，信号特异性依赖于ACh的酶促反应。定量分析表明，单个囊泡平均存储229,700±17,794个ACh分子，HC-3处理使存储量降低76.75%，洗脱后部分恢复。

胞吐释放动力学与亚量子释放模式的揭示

通过单细胞安培法（SCA）监测高钾刺激下的ACh释放，发现单个囊泡释放约83,391±2,812个ACh分子，而囊泡存储量为215,281±8,806个分子，释放比例约为39%，首次证实ACh在原发性胆碱能神经元中呈亚量子释放模式。研究进一步利用一维卷积神经网络（1D-CNN）对释放峰形进行智能分类，识别出简单峰、平台峰、上升峰、下降峰和重叠峰五种类型。复杂峰型（如平台峰、上升峰）的ACh释放量显著高于简单峰，且差异主要源于半峰宽（t_half）等动力学参数的变化，说明融合孔开闭动力学是调控释放模式的关键因素。

人脊髓类器官中的ACh释放研究

在人脊髓类器官（hSCOs）的胆碱能神经元中，IVIEC与SCA检测显示单个囊泡ACh存储量为127,847±7,332个分子，释放量为45,109±2,933个分子，释放比例约为32%，再次验证亚量子释放的保守性。1D-CNN分类显示简单峰占66%，复杂峰型比例较高，说明人源神经元中ACh释放具有相似的动力学调控多样性。

唐氏综合征模型中的ACh释放异常

在唐氏综合征（DS）模型小鼠的胆碱能神经元中，单囊泡ACh存储量（101,073±8,820）和释放量（62,503±2,864）均显著低于对照组，但释放比例从33%升高至62%，提示病理状态下存在补偿性释放调节机制。1D-CNN分析进一步发现，DS神经元中简单峰事件的释放动力学参数（t_half、t_rise、t_fall）显著缩短，表明融合孔开闭加速。Western blot检测显示DS小鼠脑内胆碱乙酰转移酶（ChAT）及突触相关蛋白（STX1A、SNAP-25）表达下调，这可能是ACh合成减少与释放动力学加速的结构基础。

结论与展望

M@E@CF纳米传感器平台实现了活体胆碱能系统单囊泡化学信号的高时空分辨率解析，不仅首次证实ACh的亚量子释放模式，还揭示了DS等疾病状态下囊泡存储与释放动力学的特异性改变。该技术为神经递质释放机制研究及神经系统疾病药物开发提供了强有力的化学工具。