《ChemistrySelect》：Phenanthrene Alkaloids From Guatteria Olivacea as Topoisomerase II Inhibitors: Theoretical Insights and Cytotoxic Evaluation
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本研究通过密度泛函理论（DFT）、分子对接、分子动力学（MD）模拟及体外细胞毒性实验，综合评价了从Guatteria olivacea中分离的三种菲并吲哚生物碱（atherosperminine A1, argentinine A2, atherosperminine N-oxide A3）作为拓扑异构酶II（Topo II）抑制剂的潜力。结果表明，A1与DNA-Topo II切割复合物结合稳定（结合能-8.3 kcal mol?1），并在多种癌细胞系（MCF-7, HCT116, HepG2, HL-60）中显示出显著细胞毒性（IC5010.22–13.01 μg mL?1）。ADME预测提示A1具有较优的药代动力学特性。该研究为开发新型Topo II抑制剂提供了理论依据和实验支持。
引言
菲并吲哚生物碱是一类结构上与阿朴啡类生物碱相关的稀有天然产物，具有多种生物活性。本研究聚焦于从Guatteria olivacea（番荔枝科）中分离得到的三种菲并吲哚生物碱：atherosperminine (A1)、argentinine (A2)和atherosperminine N-oxide (A3)。尽管这些化合物先前已被分离和结构鉴定，但其电子反应性、与相关生物靶点的相互作用以及构效关系尚未得到系统研究。本研究首次采用整合的计算与生物学方法，通过DFT计算评估其几何结构、电子特性、溶剂化性质及反应性描述符（如HOMO-LUMO能隙、分子静电势MEP、平均局部电离能ALIE和Fukui指数）。分子对接分析考察了它们与DNA拓扑异构酶II（Topo II）的相互作用，Topo II因其在DNA复制和染色体组织中的关键作用而成为重要的抗癌靶点。同时，也研究了它们与人血清白蛋白（HSA）的结合。体外细胞毒性实验在MCF-7（人乳腺癌腺癌）、HCT116（人结肠癌）、HepG2（人肝癌）和HL-60（人早幼粒白血病）细胞系上进行，以补充理论结果。
前沿分子轨道分析
通过DFT计算在M06-2X/6-311++G(2df,3p)水平上分析了A1、A2和A3的最高占据轨道（HOMO）和最低未占轨道（LUMO）能量。计算得到的全局反应性描述符，如化学硬度（η）、化学势（μ）和亲电性指数（ω），表明这三种生物碱均属于软分子（即反应性较高）。与真空相比，在大多数溶剂中，HOMO-LUMO能隙和化学硬度略有增加，表明在溶液中的反应性降低。A1、A2和A3的亲电性指数（ω）在气相中分别为2.0216 eV、2.0502 eV和2.0305 eV，属于中等强度亲电体。电子给予能力（ω?）和电子接受能力（ω+）在溶剂中略有增强，表明在溶液中电子接受倾向增加，电子给予倾向减弱（乙腈和氯仿除外）。HOMO轨道主要分布在A、B和C环（除C12、H21、C1和H16原子外）以及O22和O23原子上。对于A1和A2，LUMO离域在A、B和C环上，而在A3中，LUMO集中在C12、C32和C43原子上方。
溶剂化自由能估算
使用Truhlar的SMD溶剂化模型计算了A1、A2和A3在乙腈、氯仿、乙醇和水中的溶剂化自由能。所有计算值均为负值，表明这些化合物在所测试的溶剂中具有良好的溶剂化能力。分子A1在乙腈中显示出最低的溶剂化能（-15.34 kcal mol?1），表明该生物碱在此溶剂中溶解性更好。分子A2和A3在乙醇中表现出最低的溶剂化能值（分别为-17.67和-27.14 kcal mol?1），提示乙醇是溶解这些化合物的最合适溶剂。在三种生物碱中，分子A3在所有测试溶剂中均显示出最低的溶剂化能值，表明其溶解性最佳，而分子A1的溶剂化能值最高。A3分子中N-oxide基团的存在促进了与溶剂分子形成离子-偶极和氢键相互作用，这解释了其较高的溶剂化值。A2分子在C13碳上连接有羟基而非甲基，能与溶剂分子形成氢键，这解释了其相对于A1更高的溶剂化能力。
MEP和ALIE表面分析
分子静电势（MEP）和平均局部电离能（ALIE）表面对于分析分子反应性和预测分子间相互作用至关重要。MEP图显示，负电势区域主要位于A、B和C环以及所有分子中的O22和O23氧原子上，还有A2中的N34和A1中的N38氮原子上。在A3中，O47原子由于局域负电荷而表现出最强的负电势。正电势出现在所有结构的甲基氢原子上，特别是A3中与带正电氮原子键合的氢原子。ALIE表面识别出A、B和C环以及A1和A2中的N38是更容易受到亲电攻击的位点。氧原子通常显示出较高的电离能（约0.40 a.u.），表明它们更倾向于与阳离子发生静电相互作用而非亲电反应。然而，在A3中，O47原子具有显著较低的电离能，表明除了高电子密度外，它也容易受到亲电攻击。此外，A1和A2中氮原子N38和N34的碱性特征通过其低的ALIE值（约-0.035 a.u.）得到确认，这意味着其电子对束缚较松，是潜在的质子化位点。
Fukui函数
Fukui函数是概念DFT中的关键描述符，广泛用于预测化学反应中的位点选择性。通过有限差分近似（FDA）计算了A1、A2和A3分子的Fukui指数表面。关于亲核攻击（f+(r)表面），三种结构在三个芳香环上，特别是在C1、C4、C6、C10、C11、C14和C35原子以及C13=C12和C3=C7双键处显示出反应位点。容易受到亲电攻击的区域（f?(r)表面）位于A环和B环，特别是C13=C14、C11=C9和C10=C7双键，以及O22和C35（对于A1）和C31（对于A2和A3）原子。关于f0(r)描述符，容易发生自由基攻击的位点是C11、C10、C7、C4、C6和O22原子以及三种结构的C13=C14双键。f2(r)等值面显示，对于所有三种结构，A环和B环反应性更强。具体来说，C7和O22原子以及C14=C13和C10=C7双键主要是亲核区域（呈现负等值）。同时，C10原子和C3=C7双键主要是亲电区域（容易受到亲核攻击，呈现正等值）。
分子对接
分子对接计算旨在研究A1、A2和A3与人血清白蛋白（HSA）和DNA拓扑异构酶II（Topo II）的相互作用，以评估它们的血液运输潜力和抗肿瘤活性。对于HSA的Drug Site 1（PDB: 2BXD），A1、A2和A3的最高打分构象结合能分别为-7.9、-8.4和-8.3 kcal mol?1（重新对接的华法林为-9.1 kcal mol?1）。结合模式分析表明，A1通过氢键与Arg222相互作用；与Ala291、Leu238和Leu238形成π-σ相互作用；以及与Ala261、Leu260和Ile264形成π-烷基相互作用。A2通过氢键与Lys199相互作用；与Ile264、Leu260和Leu234形成π-烷基相互作用；与Leu238和Ala291形成π-σ相互作用；以及与Arg257和His242形成碳-氢键相互作用。A3通过氢键与Arg222和Gln196相互作用；与Lys199形成碳-氢键；与Ala291、Leu238和Ile290形成π-σ相互作用；以及与Ala261、Ile264和Leu260形成π-烷基相互作用。在Drug Site 2（PDB: 2BXG），A1、A2和A3的结合能分别为-6.3、-6.8和-6.6 kcal mol?1（重新对接的布洛芬为-7.2 kcal mol?1）。尽管两个位点都显示出有利的结合，但Drug Site 1能更有效地容纳这些生物碱，显示出更负的结合分数。Drug Site 1已知更倾向于结合缺乏羧基的大体积杂环配体（如华法林），而Site 2则优先结合具有芳香环和羧酸盐且呈伸展构象的配体（如布洛芬）。
关于DNA-Topo II切割复合物（PDB: 5GWK），A1、A2和A3的最高打分构象结合能分别为-8.3、-8.2和-8.5 kcal mol?1（重新对接的依托泊苷为-11.8 kcal mol?1）。A1在切割复合物的药物结合口袋内与核苷酸DG13和DC8以及Ser763形成碳-氢键；与DT9、DC8和DG13形成π-π堆积相互作用；以及与Arg487和Met762形成烷基/π-烷基接触。A2显示出类似的相互作用模式，但由于O22处缺少O-甲基基团，缺乏与Met762的烷基相互作用，降低了其疏水相互作用潜力。A3与DC8和DG13建立氢键相互作用，与DT9和DG7形成碳-氢键，与DT9、DC8和DG13发生π-π堆积，并与Arg487形成π-烷基相互作用。尽管对接分数相似，但A1和A2与四个核苷酸碱基相互作用，而A3与三个相互作用。A3在切割复合物内形成了三个氢键，但A1和A2与Topo II的关键氨基酸残基发生了更广泛的疏水相互作用。
分子动力学分析
进行了100 ns的全原子分子动力学（MD）模拟，以分析DNA-拓扑异构酶II复合物在其未结合形式（APO）以及与生物碱A1、A2和A3复合（分别命名为TOP1、TOP2和TOP3）时的构象行为。关键描述符如均方根偏差（RMSD）、均方根涨落（RMSF）、回转半径（Rg）、溶剂可及表面积（SASA）和氢键分布均被评估。所有系统在前20 ns内达到平衡，并在整个模拟期间保持结构稳定性。RMSD曲线显示TOP1和TOP3与APO复合物相似，而TOP2呈现出略高的偏差，可能是由配体A2引起的结构紧凑性降低所致。平均RMSD值为：APO (0.33 ± 0.03 nm)、TOP1 (0.29 ± 0.04 nm)、TOP2 (0.51 ± 0.11 nm)、TOP3 (0.33 ± 0.04 nm)，支持了复合物在100 ns时间范围内的整体稳定性。RMSF计算揭示了沿蛋白质链的局部原子灵活性。大多数区域在复合物之间显示出相似的涨落曲线，平均RMSF值在0.18至0.21 nm之间。值得注意的是，TOP3复合物中580-620号残基表现出更高的涨落，表明该区域流动性更大，这与其RMSD曲线一致。Rg分析用于评估每个系统的结构紧凑性。APO、TOP1和TOP3复合物保持了相似的Rg值（约3.31–3.36 nm），而TOP2显示出轻微增加（3.44 ± 0.04 nm），特别是在40 ns后，表明与A2结合后蛋白质尺寸有轻微扩张。这一观察结果与同一系统观察到的略高RMSD一致。监测SASA值以评估配体结合后的溶剂暴露变化。结果在整个模拟过程中是稳定的，平均值为：APO (383.86 ± 5.1 nm2)、TOP1 (384.68 ± 4.6 nm2)、TOP2 (391.76 ± 4.9 nm2)、TOP3 (389.76 ± 6.03 nm2)。这些结果表明溶剂相互作用一致，且复合物之间溶剂可及性没有剧烈变化。分析了配体与蛋白质之间形成的氢键数量随时间的变化。TOP1维持1-7个氢键，TOP2在1-8之间，TOP3在1-6之间。在早期阶段（前20 ns），所有复合物形成了较多氢键，在30-80 ns之间略有下降。在模拟接近结束时，氢键数量再次增加，特别是TOP2和TOP3，分别达到8个和6个。
自由能景观
自由能景观（FEL）图显示了系统自由能随关键参数（如主成分PC1和PC2）的变化。生成的APO、TOP1、TOP2和TOP3的FEL图显示，较深的蓝色区域表示具有较低能量的更稳定的蛋白质构象，而黄橙色区域表示能量上不利的构象状态。FEL图显示APO、TOP1、TOP2和TOP3复合物表现出不同的全局最小值，表明存在不同的最低能量构象。值得注意的是，TOP2复合物呈现出最大数量的蓝色能量阱，表明随时间发生了更大的构象变化。另一方面，TOP1和TOP3复合物表现出较少的能量阱，并且在这些阱之间存在黄橙色峰（较高能量区域），表明需要一定的能量来克服能量势垒以实现构象变化。
MM-PBSA分析
MM-PBSA方法结合了分子力学项和溶剂化效应，用于估算每个配体-蛋白质复合物的结合自由能。TOP1、TOP2和TOP3复合物的平均能量组分总结如下。范德华能量项，反映了伦敦色散和其他非键合疏水接触，对TOP2最有利，表明A2与DNA-Topo II口袋形成了更多近距离疏水相互作用。静电能量项，反映了分子中带电或部分带电原子与酶之间的相互作用，对TOP2也更负，表明该复合物中存在更强的电荷-电荷和偶极相互作用。然而，这些有利的贡献被极性溶剂化能量大大抵消，该值对TOP2是强正值。这表明当A2结合时，去溶剂化惩罚更高，与MD轨迹中观察到的更大的结构涨落和增加的溶剂暴露（更高的RMSD、Rg和SASA值）一致。相比之下，TOP1（A1）和TOP3（A3）显示出更平衡的能量分布，具有中等有利的范德华和静电项，结合了较低的极性溶剂化惩罚。因此，它们的总体MM-PBSA结合自由能比TOP2更有利，其中TOP3呈现出最负的平均值。考虑到相关的标准偏差，相对能量表明A1和A3比A2结合更有利，这与MD模拟期间观察到的结构稳定性趋势一致。总体而言，MM-PBSA结果表明所有三种生物碱在位于DNA-Topo II切割位点的药物结合口袋处形成稳定的相互作用，从而稳定了切割复合物。然而，A1和A3在相互作用能量和溶剂化成本之间表现出更有利的平衡，而A2在结合时经历了更大的去溶剂化惩罚并诱导了更大的构象涨落。
ADME预测
吸收、分布、代谢和排泄（ADME）参数对于评估化合物的药代动力学适用性至关重要。化合物A1在不同模型中的脂溶性值在3.36至4.66之间，得出共识logP为4.06，符合Lipinski对口服生物可利用分子的建议。预测的水溶性从中等（ESOL和Ali）到低（SILICOS-IT）不等。在药代动力学方面，A1显示出高胃肠道吸收、预测的BBB渗透性、无P-gp识别以及对CYP1A2、CYP2C19和CYP2D6的抑制作用。预测的皮肤渗透性为-4.88 cm s?1。对于A2，logP预测范围在3.13至4.34之间，共识值为3.69，也在药物相似性指南范围内。溶解度预测表明在ESOL和Ali中为中等水溶性，在SILICOS-IT中为低溶解度。A2显示出高GI吸收、BBB渗透，并抑制与A1相同的CYP亚型。其预测的皮肤渗透性为-5.02 cm s?1。化合物A3显示出显著较低的脂溶性（共识logP = 2.65），模型依赖值范围从1.10到4.19。溶解度预测表明在ESOL和Ali中为中等水溶性，而SILICOS-IT将A3归类为难溶性，与A1和A2相似。A3被预测具有高GI吸收和BBB渗透性，不是P-gp底物，并且仅抑制两种代谢酶（CYP1A2和CYP2D6）。尽管有这些有利方面，但A3中由N-oxide基团引入的低脂溶性和增加极性表明其分配到疏水微环境（包括细胞膜和大部分疏水生物环境）的能力降低，这可能有助于解释其缺乏细胞毒性活性。生物利用度雷达图表明所有三种化合物都落在口服药物相似性的可接受物理化学空间内。没有违反SwissADME工具中实施的Lipinski、Ghose、Veber、Egan或Muegge规则。
体外细胞毒性实验
为了实验评估计算机预测所提示的细胞毒性潜力，对生物碱A1、A2和A3针对一组人类癌细胞系进行了评估，包括MCF-7（乳腺癌）、HCT116（结直肠癌）、HepG2（肝癌）和HL-60（早幼粒白血病）。还包括非恶性人肺成纤维细胞系（MRC-5）作为选择性对照。所有化合物在最高浓度25 μg mL?1下进行测试。在所评估的生物碱中，A1（atherosperminine）对所有肿瘤细胞系表现出持续的抑制活性，IC50值在10.22至13.01 μg mL?1之间，对非恶性MRC-5细胞的IC50值为15.51 μg mL?1（50.19 μmol L?1）。A2（argentinine）表现出有限的细胞毒性，仅对HCT116细胞显示出可测量的活性（IC50= 20.36 μg mL?1），而对其他肿瘤模型保持无活性。相比之下，A3（atherosperminine N-oxide）在实验条件下未显示出显著的细胞毒性效应。
结论
本研究通过结合DFT、分子对接、MD、MM-PBSA和生物学评估方法，考察了来自G. olivacea的三种菲并吲哚生物碱：atherosperminine (A1)、argentinine (A2)和atherosperminine N-oxide (A3)。量子化学分析将这些分子归类为软分子，根据MEP、ALIE和Fukui描述符，A环和B环被确定为反应性最强的区域。对接结果显示它们优先结合HSA的Drug Site 1，并与DNA-Topo II切割复合物发生有利相互作用，所有化合物的结合能在-8.2至-8.5 kcal mol?1之间。分子动力学模拟证实了这三种生物碱在100 ns内与Topo II-DNA复合物稳定结合，得到了一致的RMSD、Rg、SASA和MM-PBSA谱图的支持。尽管A3显示出更强的溶剂化能量和略更有利的MM/PBSA结合自由能，但其较低的脂溶性（共识logP 2.65）和较高的极性可能降低了膜通透性，并限制了其在细胞环境中与靶点的有效结合。相比之下，A1显示出更平衡的物理化学特性（更平衡的脂溶性/溶解性），具有足够的脂溶性以穿透细胞并与疏水生物微环境有效相互作用。这种平衡反映在其与Topo II内部更紧密的相互作用网络以及A1-Topo II复合物稳定而紧凑的动态行为中。这些发现为体外结果提供了机理上的解释：A1是唯一在所有测试的癌细胞系（MCF-7、HCT116、HepG2、HL-60）和非肿瘤谱系MRC-5上均显示出细胞毒活性的化合物。因此，该研究强调了atherosperminine (A1)是来自G. olivacea的最有前途的菲并吲哚生物碱，并展示了整合的量子化学、分子建模和体外方法如何阐明影响生物活性的结构和物理化学决定因素。
