《International Journal of Oral Science》：MARCH2 suppresses odontoblast differentiation by polyubiquitinating PTPRD
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本研究揭示了膜相关E3泛素连接酶MARCH2通过介导蛋白酪氨酸磷酸酶受体δ（PTPRD）的K27连接多聚泛素化及溶酶体降解途径，负向调控成牙本质细胞分化和牙本质形成的新机制。研究人员通过基因敲除、病毒介导的细胞特异性敲降等技术证明抑制MARCH2可显著增强牙本质沉积，为牙本质再生治疗提供了潜在靶点。
牙齿发育过程中，成牙本质细胞如何精确调控分化进程始终是口腔发育生物学领域的关键科学问题。作为牙体硬组织的主要构成成分，牙本质由分化的成牙本质细胞分泌形成，其异常分化会导致牙本质形成缺陷。尽管已知某些膜蛋白参与调控成牙本质细胞分化，但蛋白质翻译后修饰特别是泛素化修饰在这一过程中的作用机制尚不明确。
膜相关RING-CH（MARCH）家族E3泛素连接酶是一类定位于细胞膜和细胞器膜的调控因子，通过调节膜蛋白稳定性参与多种发育过程。然而，该家族成员在牙本质形成中的作用仍是未解之谜。发表于《International Journal of Oral Science》的最新研究首次揭示MARCH2通过泛素-蛋白酶体系统调控成牙本质细胞分化的分子通路。
研究人员首先通过表达谱筛查发现，在鼠牙乳头细胞（mDPCs）成牙本质分化过程中，MARCH2在所有MARCH家族成员中表达最高且呈上升趋势。体内实验显示，在出生后2天（PN2）小鼠切牙和胚胎18.5天（E18.5）至PN10磨牙中，MARCH2在未分化牙乳头细胞中呈中度表达，在成牙本质细胞中强烈表达。
功能获得与缺失实验表明，敲降MARCH2可显著提升成牙本质细胞标志物Dmp1、Dspp和Col1a1的表达水平，增强碱性磷酸酶（ALP）活性和矿化结节形成；而过表达MARCH2则产生相反效果。为验证体内功能，研究团队利用CRISPR/Cas9技术构建MARCH2基因敲除小鼠，发现突变小鼠在PN10、PN14和PN21时间点均表现出牙本质厚度增加、沉积速率加快的表型。
为排除全身性基因敲除可能带来的干扰，研究人员进一步构建了基于AAV6病毒载体、由Dmp1启动子驱动的成牙本质细胞特异性敲降模型。局部注射AAV6-shMarch2至下颌磨牙牙胚后，83%的成牙本质细胞实现GFP标记，特异性敲降组重现了全身敲除小鼠的牙本质增厚现象。
机制探索方面，通过生物信息学分析和实验验证，研究团队锁定蛋白酪氨酸磷酸酶受体δ（PTPRD）为MARCH2的作用靶点。免疫共沉淀（Co-IP）和原位邻位连接技术（PLA）证实MARCH2与PTPRD存在直接相互作用。泛素化实验显示MARCH2通过其E3连接酶活性促进PTPRD的K27连接多聚泛素化，而酶活性位点突变体（C64S/C67S/C80S）则丧失该功能。
通过抑制剂干预实验，研究人员发现溶酶体抑制剂氯喹（CQ）可阻断MARCH2介导的PTPRD降解，而蛋白酶体抑制剂MG132无此作用。细胞定位实验进一步揭示MARCH2促进PTPRD从细胞膜向溶酶体转运，证实其通过溶酶体途径降解PTPRD。
功能挽救实验表明，单独敲降PTPRD会损害成牙本质细胞分化，而同时敲降March2和Ptprd可逆转因March2缺失带来的促分化效应，证实PTPRD是MARCH2发挥作用的关键下游介质。
本研究创新性地绘制出MARCH2-PTPRD调控轴在成牙本质细胞分化中的精细调控网络：MARCH2通过催化PTPRD的K27连接多聚泛素化，促进其溶酶体降解，从而抑制成牙本质细胞分化和牙本质形成。
技术方法方面，研究主要运用了：1）基因编辑技术（CRISPR/Cas9构建March2基因敲除小鼠模型）；2）病毒载体技术（AAV6介导的成牙本质细胞特异性基因敲降）；3）显微CT成像与三维重建（牙本质形态定量分析）；4）分子互作检测技术（免疫共沉淀、原位邻位连接实验）；5）细胞分化功能实验（碱性磷酸酶染色、茜素红染色等）。
研究结论表明，MARCH2作为负向调控因子，通过泛素-溶酶体途径降解促分化膜蛋白PTPRD，维持牙本质形成的平衡。该发现不仅深化了对牙齿发育调控网络的认识，更为牙本质再生治疗提供了新靶点。通过调控MARCH2-PTPRD轴，可能为牙髓损伤、牙本质龋坏等疾病的再生治疗开辟新途径。
该研究的创新点在于首次揭示E3连接酶通过修饰膜蛋白调控成牙本质细胞分化的新机制，突破了过去E3连接酶主要靶向胞质或核蛋白的研究局限。研究团队由武汉大学口腔医学院的Hao Feng、Jiaxin Niu等学者完成，为口腔发育生物学领域提供了重要理论依据。
