《Scientific Reports》：Computational characterization of GRP78 binding sites on mitochondrial GPX4: implications for targeting ferroptosis in triple-negative breast cancer
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本研究针对三阴性乳腺癌(TNBC)治疗选择有限的难题，通过计算生物学方法系统揭示了分子伴侣GRP78与线粒体谷胱甘肽过氧化物酶4(mGPX4)的相互作用机制。研究人员采用蛋白质-蛋白质对接、分子动力学模拟和MM/GBSA结合自由能计算等技术，发现GRP78的SBDβ结构域与mGPX4多个区域形成稳定复合物，其中区域II结合亲和力最高(△G=-86.39 kcal/mol)。这一发现为通过破坏GRP78-mGPX4相互作用来增强TNBC细胞对铁死亡诱导剂的敏感性提供了新靶点。
在乳腺癌的诸多亚型中，三阴性乳腺癌(TNBC)以其侵袭性强、易转移和治疗选择有限而备受关注。约占所有乳腺癌病例20%的TNBC，由于缺乏雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(HER2)的表达，使得常规的靶向治疗难以奏效。尽管化疗仍是主要治疗手段，但TNBC患者往往面临更高的远处复发风险和更差的总体生存率。在这一背景下，探索新的治疗策略成为当务之急。
近年来，铁死亡(ferroptosis)作为一种新发现的调节性细胞死亡形式，在癌症治疗领域展现出巨大潜力。这种铁依赖性的细胞死亡由脂质氢过氧化物积累触发，而其关键调控因子谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的功能障碍则是导致铁死亡的核心机制。有趣的是，癌细胞特别是TNBC细胞，能够通过某种机制逃避铁死亡诱导剂的杀伤，从而在氧化应激环境下存活。
那么，TNBC细胞是如何获得这种抵抗能力的呢？研究人员将目光投向了葡萄糖调节蛋白78(GRP78)。作为内质网应激反应的关键分子伴侣，GRP78在多种癌症中过度表达，支持肿瘤生存、增殖、化疗耐药、血管生成和转移。尽管GRP78以其在内质网中结合错误折叠蛋白质而闻名，但它在肿瘤细胞表面的出现以及其与GPX4的潜在相互作用，可能为解释TNBC细胞的铁死亡抵抗提供了线索。
为了深入探究这一问题，发表在《Scientific Reports》上的这项研究采用了一系列先进的计算生物学方法。研究人员主要通过以下关键技术展开研究：利用AlphaFold2预测线粒体GPX4(mGPX4)的三维结构并进行模型优化验证；运用HADDOCK 2.4进行GRP78与mGPX4的蛋白质-蛋白质对接分析；通过GROMACS进行100纳秒的分子动力学模拟，评估复合物稳定性；采用MM/GBSA方法计算结合自由能并进行能量分解。
3.1. Pep42与GPX4功能区域的比较三维结构分析
研究人员首先利用AlphaFold2生成了mGPX4的三维结构模型，该模型平均pLDDT值为89.4，表明整体拓扑结构的高置信度。特别值得注意的是，mGPX4的N端线粒体靶向片段(残基1-27)得分低于50，反映了其在导入前的固有无序特性，而包含区域7的催化核心则表现出高pLDDT值(>85)和明确定义的二级和三级结构。序列比对显示，GPX4区域R1、R2、R3和R7与Pep42的同一性分别为30%、30.77%、38.46%和42.86%，且多个保守残基被观察到。重要的是，所有GPX4区域均表现出与Pep42相似的疏水性特征(GRAVY指数约为1.2-1.5)，且约80-93%的残基为非极性残基，这种物理化学性质的相似性为它们与GRP78的类似结合行为提供了基础。
3.2. 全长mGPX4包膜与GRP78的结合
对接实验揭示了GRP78与mGPX4的最佳结合模式。PRODIGY预测的结合亲和力从-7.7±0.5到-10.5±0.6 kcal/mol，均超过环肽Pep42的亲和力(-6.9±0.1 kcal/mol)。位于线粒体导入区域的区域III表现出最高的结合亲和力(△G=-10.5±0.6 kcal/mol)。基于HADDOCK结果，区域II被确定为最优结合位点，得分为-72.0±5.4，显著优于其他区域。从结构角度看，区域II采用稳定的螺旋-环构象，富含溶剂暴露的疏水和极性侧链，这种排列完美地嵌入GRP78的疏水沟槽，同时形成稳定的氢键网络。
相互作用的分子机制分析表明，GRP78主要通过氢键和疏水相互作用与mGPX4结合。在区域II复合物中，GRP78 SBDβ形成了8个氢键和3个疏水相互作用，创建了连续的极性接触链，使mGPX4中央片段沿GRP78的β-片层边缘对齐。这些广泛的极性-疏水相互作用可能构成了mGPX4识别的核心稳定界面。
3.3. GRP78与mGPX4结合的构象动力学和能量表征
分子动力学模拟分析了GRP78结合对mGPX4构象稳定性的影响。RMSD分析显示，未结合的mGPX4波动较大(平均16.31 ?)，而GRP78则表现出显著稳定性(平均5.27 ?)。与GRP78形成复合物后，区域VII和区域II复合物使mGPX4的RMSD最大程度降低(分别为9.83 ?和13.34 ?)，反映了结合后结构稳定性的提高。
RMSF分析进一步表明，GRP78在区域VII的结合产生了所有复合物中最低的RMSF(3.82 ?)，表明局部残基运动受到明显限制。相比之下，在区域I、II和III的结合增加了mGPX4的RMSF(7.25-7.99 ?)，表明局部流动性增加。回转半径(Rg)分析显示，与线粒体靶向区域I、II和III对应的复合物表现出最高的Rg值(39.36-41.31 ?)，表明GRP78在这些位点的结合松弛了蛋白质结构，可能揭示或改变了线粒体导入信号。
溶剂可及表面积(SASA)分析表明，mGPX4-R1/GRP78复合物显示出最大的平均SASA(64851.29 ?2)，表明结合诱导了更开放、灵活的构象。氢键分析显示，GRP78在区域II、III和VII与mGPX4结合时，平均氢键数量显著增加至198-200个，表明通过密集、稳定的氢键网络显著增强了结构完整性。
3.3.1. 结合自由能结果和能量贡献
MM-GBSA分析显示，复合物2(mGPX4-R2/GRP78)具有最有利的总结合自由能(-86.39 kcal/mol)，主要来自强静电相互作用(△Eel=-321.56 kcal/mol)和显著的范德华力(△VdWaals=-74.25 kcal/mol)。复合物4的结合自由能较低(-45.20 kcal/mol)，但具有更紧凑和结构稳定的界面，具有平衡的范德华力和静电贡献。每个残基的结合能量贡献分析确定了GRP78中ARG1488、VAL1490和VAL1453等关键残基，这些残基在不同mGPX4-GRP78 SBDβ复合物中稳定结合中起关键作用。
研究结论表明，GRP78通过其底物结合域β(SBDβ)与mGPX4的特异性相互作用，可能在TNBC细胞抵抗铁死亡中发挥关键作用。在分析的区域中，区域II提供最高的结合能量，而区域VII形成最紧凑、潜在最稳定的复合物，使得这两个位点对于GRP78-mGPX4相互作用都至关重要。这些发现为设计破坏该复合物的抑制剂奠定了基础，旨在抑制肿瘤生长、克服耐药性并削弱癌细胞存活。
这项研究的重要意义在于揭示了一个新的治疗策略：通过破坏GRP78-GPX4相互作用来 destabilize GPX4，削弱其保护功能，从而使TNBC细胞对铁死亡诱导剂敏感。由于TNBC缺乏特异性靶向治疗且经常对标准治疗产生耐药性，这种方法可能作为有价值的补充或辅助选择。能够阻断GRP78稳定GPX4的小分子、肽或抗体，有潜力增强铁死亡基础治疗的疗效，绕过耐药机制，最终改善TNBC的临床结局。
