拟南芥与弓形虫Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂的广谱抗植物病原菌活性及其作用机制研究

《Scientific Reports》：Kazal-type serine protease inhibitors from Arabidopsis thaliana and Toxoplasma gondii exhibit antimicrobial activity against plant pathogens

本研究针对植物病害防治中新型生物农药的迫切需求，聚焦于Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂(KPIs)的抗菌功能。研究人员系统评估了拟南芥来源的rAtKPI-1T和弓形虫来源的rTgPI-1及其截短体(rTgPI-1NT/rTgPI-1CT)对丁香假单胞菌和灰葡萄孢的抗病原活性。结果表明这些重组KPIs能浓度依赖性地抑制细菌生长(rTgPI-1对P. viridiflava的MIC50低至1μM)，并通过表面结合和蛋白酶抑制双重机制发挥作用。该研究揭示了KPIs结构域功能分化的新规律，为开发靶向病原菌关键蛋白酶的新型生物制剂提供了理论依据。

　　

在农业生产中，病原微生物导致的作物病害每年造成巨大的经济损失。其中，由丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）引起的细菌性病害和由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引发的灰霉病尤为突出，传统化学农药的过度使用不仅导致病原菌抗药性增强，还带来环境污染和食品安全问题。因此，开发新型、高效、环境友好的生物防治策略成为当务之急。

植物在长期进化过程中形成了一套复杂的防御系统，丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serine Protease Inhibitors, SPIs）是其中重要的组成部分。它们能够抑制病原微生物分泌的丝氨酸蛋白酶，这些蛋白酶是病原菌破坏植物组织、获取营养的关键毒力因子。Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂（Kazal-type Serine Protease Inhibitors, KPIs）是SPIs家族中特征较为明确的一类，在动物和微生物中研究较多，但其在植物防御系统中的具体功能，特别是针对植物病原菌的抑制作用机制，尚不清晰。

在此背景下，由Manuel A. Sanchez、Karen N. Strack、Luisa F. Mendoza-Morales等作者组成的研究团队，在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果。该研究深入探究了来源于模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）的AtKPI-1和来源于专性细胞内寄生原虫弓形虫（Toxoplasma gondii）的TgPI-1这两种KPIs的抗植物病原菌活性。研究人员不仅评估了全长蛋白（rAtKPI-1T和rTgPI-1）的效果，还创新性地构建并分析了TgPI-1的两个截短变体——包含N端第1、2结构域的rTgPI-1_NT和包含C端第3、4结构域的rTgPI-1_CT，旨在揭示不同Kazal结构域在抗菌功能中的特异性贡献。

为了开展这项研究，作者团队运用了多项关键技术。他们通过原核表达系统（大肠杆菌BL21(DE3)和M15）制备了重组KPIs，并利用镍柱亲和层析进行纯化。抗菌活性通过细菌生长抑制实验和最小抑制浓度（MIC₅₀）测定进行评估。分子相互作用机制则通过细菌结合实验和间接免疫荧光（IIF）技术进行探究。此外，针对灰葡萄孢的防治潜力，通过分生孢子萌发抑制实验进行验证。

表达和纯化重组KSPIs

研究人员成功表达了带有His标签的重组蛋白rAtKPI-1T、rTgPI-1及其两个截短版本rTgPI-1_NT和rTgPI-1_CT。rTgPI-1_NT包含具有胰蛋白酶抑制特异性的结构域，而rTgPI-1_CT则包含具有弹性蛋白酶抑制特异性的结构域。通过镍亲和层析，从大肠杆菌裂解液中纯化出了可溶性的重组蛋白，为后续功能研究奠定了基础。

rAtKPI-1T、rTgPI-1、rTgPI-1_NT和rTgPI-1_CT的细菌生长抑制活性

研究结果显示，四种重组KPIs在7μM浓度下均能有效抑制三种植物病原细菌（P. syringae DC3000、P. syringae (AvRpm1)和P. viridiflava）的生长。在3.5μM浓度下，不同KPIs的抑制效果出现差异。进一步的MIC₅₀（半数抑制浓度）测定表明，rTgPI-1及其截短体（尤其是rTgPI-1_CT）的抗菌活性普遍强于rAtKPI-1T。例如，rTgPI-1和rTgPI-1_CT对P. viridiflava的MIC₅₀低至1μM，而rAtKPI-1T为10μM。此外，研究人员还探索了rTgPI-1_NT和rTgPI-1_CT的协同作用，发现在抑制P. viridiflava时，两者混合使用可达到与全长rTgPI-1相似的效果，提示了结构域间的 additive effect（相加效应）。

rAtKPI-1T、rTgPI-1、rTgPI-1_NT和rTgPI-1_CT的细菌结合活性

为了探究抗菌作用的机制，研究人员进行了细菌结合实验。结果表明，rAtKPI-1T、rTgPI-1和rTgPI-1_NT能够与测试的细菌结合，但结合强度与特性不同。rAtKPI-1T与细菌的结合非常牢固，即使在SDS处理后仍存在于沉淀中。rTgPI-1和rTgPI-1_NT则表现为较弱或可逆的结合。而rTgPI-1_CT的结合最弱，仅在SDS处理前的步骤中能被检测到。间接免疫荧光实验直观地证实了这些结合差异，并显示不同KPIs在细菌表面的定位存在菌株特异性，例如rTgPI-1能与所有三种测试细菌结合，而rTgPI-1_CT主要结合P. syringae (AvRpm1)和P. viridiflava。

rTgPI-1_NT和rTgPI-1_CT对灰葡萄孢分生孢子萌发的体外抑制

除了抗菌活性，研究还评估了截短蛋白的抗真菌效果。rTgPI-1_NT和rTgPI-1_CT均能显著抑制灰葡萄孢分生孢子的萌发和芽管伸长，且抑制作用呈浓度和时间依赖性。值得注意的是，在286 nM浓度下，rTgPI-1_CT的抑制效果显著强于rTgPI-1_NT，表明C端结构域在抗真菌活性中扮演了更关键的角色。

综上所述，本研究系统地证实了来源于拟南芥和弓形虫的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂具有广谱的抗植物病原菌活性。其作用机制涉及对病原菌的直接结合以及对其关键丝氨酸蛋白酶的抑制。研究的一个重要发现是，多功能KPIs的不同结构域（如rTgPI-1的N端和C端）可能具有独特且互补的生物学功能：rTgPI-1_NT（P1位点为精氨酸，倾向于抑制胰蛋白酶样蛋白酶）在抑制某些细菌方面表现较好，而rTgPI-1_CT（P1位点为亮氨酸，倾向于抑制弹性蛋白酶样蛋白酶）则表现出更强的抗真菌活性。这种结构域功能的特化，为未来设计具有特定靶向性的工程化蛋白酶抑制剂用于作物保护提供了宝贵的见解和全新的思路。该研究不仅深化了对植物先天免疫中蛋白酶抑制剂功能的理解，也展示了利用非植物来源（如寄生虫）的活性蛋白进行植物保护的巨大生物技术潜力，为开发新一代绿色农药开辟了新的途径。