《Scientific Reports》：Disruption of intracellular iron homeostasis through mitochondrial dysfunction associated with suppression of ATP 13A2 expression
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本研究针对帕金森病中黑质铁异常积聚的机制难题，聚焦PARK9致病基因ATP13A2，通过构建α-突触核蛋白过表达细胞模型，首次揭示了溶酶体功能障碍通过损害线粒体功能（包括线粒体自噬缺陷和血红素合成能力下降），进而破坏IRP2介导的铁稳态调控通路，最终导致细胞内Fe2+异常累积和氧化应激的关键机制。该发现为理解神经退行性疾病中铁沉积的病理过程提供了新视角。
在大脑的深处，一个名为黑质致密部的微小区域，其多巴胺神经元的进行性丧失是帕金森病（Parkinson's disease, PD）的核心病理特征。除了众所周知的α-突触核蛋白（α-Synuclein, α-Syn）聚集形成的路易小体，科学家们还发现帕金森病患者的大脑，特别是黑质区域，存在明显的铁异常积聚。铁是生命活动不可或缺的元素，但过量的铁会通过芬顿反应产生活性氧，导致氧化应激，甚至触发一种铁依赖性的新型细胞死亡——铁死亡（ferroptosis），这可能是推动帕金森病进展的关键环节。然而，长期以来，帕金森病中铁为何会异常积聚，其背后的分子机制一直笼罩在迷雾之中。
一些罕见的遗传性帕金森病病例为揭开谜底提供了线索。其中，PARK9型（又称Kufor-Rakeb综合征）是由ATP13A2基因突变引起，该病被归类为伴有脑铁积聚的神经退行性疾病（Neurodegeneration with Brain Iron Accumulation, NBIA）。ATP13A2是一种位于溶酶体膜上的P型ATP酶，对维持溶酶体的正常功能至关重要。那么，一个溶酶体蛋白的缺陷，是如何导致铁在细胞内“库存积压”的呢？这成为了一个亟待解决的科学问题。
近期，发表在《Scientific Reports》上的一项研究，正是瞄准了这一关键问题。由日本岐阜药科大学Masatoshi Inden博士领导的研究团队，利用细胞模型深入探究了ATP13A2功能缺失导致细胞内铁稳态失衡的精细机制。他们的研究绘制出了一条从溶酶体功能障碍到线粒体损伤，最终破坏铁稳态的完整通路，为理解帕金森病及其他脑铁积聚疾病的发病机制提供了新的理论框架。
关键技术方法
本研究主要使用了人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞及其稳定过表达人野生型α-突触核蛋白的细胞系（a-Syn-SH细胞）。通过小干扰RNA（siRNA）技术敲低ATP13A2或PINK1基因的表达以构建疾病模型。研究关键性地应用了一系列先进的化学荧光探针，包括：检测胞质Labile Fe2+的RhoNox-4、靶向线粒体Fe2+的MtFluNox、靶向溶酶体Fe2+的HM-RhoNox-M以及检测线粒体Labile Heme的AcH-FluNox，实现了对亚细胞水平铁和血红素动态的高分辨率实时成像。此外，还采用了原子吸收光谱法定量总铁含量、Seahorse细胞能量代谢分析系统评估线粒体呼吸功能、免疫印迹（Western blot）和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析蛋白及mRNA表达、以及商品化试剂盒检测线粒体自噬等关键技术。
研究结果
1. ATP13A2敲低引起溶酶体功能障碍和自噬受损
研究人员首先在a-Syn-SH细胞中成功敲低了ATP13A2的表达。结果发现，ATP13A2缺陷导致溶酶体pH值升高，表明其酸化功能受损。同时，自噬标志物LC3-II和p62的蛋白水平显著积累，提示自噬流（autophagic flux）被阻断。这些结果证实了ATP13A2缺失确实损害了溶酶体功能，进而影响了细胞的自噬降解能力。
2. ATP13A2敲低导致细胞内铁积聚并引发细胞毒性
通过原子吸收光谱和特异性荧光探针检测，研究发现ATP13A2敲低细胞的总体铁含量和胞质内的不稳定Fe2+水平均显著升高。更精细的亚定位分析显示，这些多余的Fe2+不仅存在于胞质，在线粒体和溶酶体中也出现了明显的积聚。作为细胞的铁储存蛋白，铁蛋白（Ferritin）的水平也随之增加。这种铁的异常累积带来了功能性后果：线粒体活性氧（ROS）水平升高，细胞存活率下降。而使用铁螯合剂去铁胺（Deferoxamine, DFO）或铁死亡抑制剂（Ferrostatin-1）处理，能够缓解氧化应激并提高细胞存活率，证明铁依赖性毒性是细胞损伤的重要原因。
3. ATP13A2敲低破坏铁稳态调控回路
在正常细胞中，细胞内铁水平受到精细的反馈调节。铁调节蛋白2（Iron Regulatory Protein 2, IRP2）是核心调控因子。当细胞内铁充足时，IRP2会被血红素依赖性机制降解，从而导致铁输入蛋白（如转铁蛋白受体Transferrin Receptor, TfR和二价金属转运体1 Divalent Metal Transporter 1, DMT1）的mRNA稳定性下降，减少铁摄入。然而，在本研究中，尽管细胞内铁已经超载，ATP13A2敲低细胞中的IRP2蛋白水平却未相应降低，TfR和DMT1的mRNA和/或蛋白表达反而异常升高，铁输出蛋白Ferroportin（FPN）则无变化。这表明，细胞感知铁水平并做出适应性反应的“刹车”系统——IRP2调控通路失灵了。
4. 抑制铁流入可缓解ATP13A2敲低引起的细胞损伤
为了验证铁流入过多是导致细胞毒性的直接原因，研究人员使用了无铁转铁蛋白（apo-Transferrin）竞争性抑制TfR介导的铁摄取，以及格列本脲（Glibenclamide）抑制DMT1活性。结果表明，这两种干预措施均能有效降低ATP13A2敲低细胞中的总铁和不稳定Fe2+水平，减轻线粒体氧化应激，并显著改善细胞活力。这证明靶向铁流入途径确实具有保护作用。
5. 线粒体功能障碍与血红素合成能力下降是铁稳态破坏的关键环节
ATP13A2位于溶酶体，其缺陷是如何影响IRP2的呢？研究人员将目光投向了线粒体。他们发现ATP13A2敲低细胞存在线粒体自噬（mitophagy）缺陷，并且线粒体功能全面受损，包括基础呼吸、最大呼吸、ATP产生量和备用呼吸容量均下降。更重要的是，使用AcH-FluNox探针检测发现，在给予血红素合成前体5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）后，ATP13A2敲低细胞的线粒体血红素合成能力显著低于对照组。已知IRP2的降解依赖于血红素。因此，线粒体功能障碍导致的血红素合成不足，很可能是IRP2无法被有效降解、铁稳态反馈调节失灵的根本原因。在PINK1敲低（另一个导致线粒体自噬缺陷的帕金森病相关基因）细胞模型中，也观察到了类似的Fe2+积聚和血红素合成能力下降的现象，支持了这一机制的普适性。
结论与意义
这项研究成功地解析了ATP13A2缺陷导致细胞内铁积聚的因果链条：ATP13A2缺失→溶酶体功能障碍→自噬/线粒体自噬受损→功能障碍线粒体累积→线粒体功能全面下降（包括呼吸功能和血红素合成能力）→血红素合成不足→IRP2降解受阻→TfR/DMT1表达失控→铁持续流入→铁超载（尤其在线粒体和溶酶体）→氧化应激/铁死亡→细胞损伤。这是一个由溶酶体缺陷触发，进而波及线粒体，最终破坏整个细胞铁稳态的恶性循环。
该研究的重大意义在于：首先，它首次将帕金森病中溶酶体、线粒体和铁代谢这三条关键病理通路有机地联系起来，提供了一个整合性的疾病机制模型。其次，研究揭示了线粒体血红素合成能力在维持铁稳态中的核心作用，以及其失调在神经退行性疾病中的新角色。最后，研究结果表明，直接抑制铁流入（如靶向TfR或DMT1）或改善线粒体功能以促进血红素合成，可能成为治疗PARK9乃至其他伴有脑铁积聚的神经退行性疾病的新策略，为未来的药物开发指明了潜在方向。
