《Virulence》：The essential role of heparan sulfate in the entry of PDCoV and other porcine coronaviruses
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本研究系统阐明了硫酸乙酰肝素（HS）作为关键宿主因子在猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV）及传染性胃肠炎病毒（TGEV）入侵过程中的核心机制。通过CRISPR-Cas9基因敲除技术，首次证实HS生物合成关键酶（SLC35B2、EXT1、NDST1）的缺失可显著抑制病毒侵染，并发现HS结合药物米托蒽醌（mitoxantrone）及竞争性抑制剂肝素钠具有剂量依赖性抗病毒活性。该研究为针对宿主HS通路开发广谱抗冠状病毒药物提供了新靶点与理论依据。
引言背景
猪肠道冠状病毒（SeCoVs）包括猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV）和传染性胃肠炎病毒（TGEV），可引发仔猪急性腹泻、呕吐及高死亡率。近年来人类感染PDCoV的病例及SADS-CoV跨物种传播潜力的发现，凸显了此类病毒的公共卫生风险。尽管已知硫酸乙酰肝素（HS）参与PDCoV结合过程，但其生物合成关键基因及具体分子机制尚未明确。
HS在PDCoV入侵中的关键作用
研究通过肝素钠（HS竞争性类似物）预处理病毒实验发现，PDCoV感染在猪肾细胞（LLC-PK1）和猪睾丸细胞（ST）中呈剂量依赖性抑制，且LLC-PK1细胞敏感性更高。VSV（不依赖HS的病毒）感染未受肝素钠影响，证实HS特异性作用。进一步利用CRISPR-Cas9技术构建SLC35B2（PAPS转运体）、EXT1（HS链延长酶）及NDST1（GlcNAc修饰酶）敲除的LLC-PK1细胞，发现三者缺失均显著降低细胞表面HS表达及PDCoV感染效率，其中EXT1与NDST1敲除抑制作用最强。
HS广谱性机制验证
肝素钠对PEDV、SADS-CoV和TGEV均表现出类似PDCoV的剂量依赖性抑制效果，表明HS是多种猪肠道冠状病毒共用的入侵辅助因子。基因敲除实验进一步显示，SLC35B2、EXT1和NDST1的缺失可显著降低这三种病毒的感染水平，而VSV感染不受影响，印证HS通路的特异性。
米托蒽醌的抗病毒潜力
HS结合药物米托蒽醌在无毒浓度（≤1 μg/mL）下可剂量依赖性抑制PDCoV感染，且预处理细胞（阻断病毒附着）效果优于感染后给药。dsRNA染色实验表明该药物还可部分干扰病毒复制阶段。类似抑制作用在PEDV、SADS-CoV和TGEV中均得到验证，提示其作为广谱抗冠状病毒药物的潜力。
EXT1的核心功能解析
病毒结合实验表明，EXT1敲除细胞中PDCoV附着率下降最显著。在LLC-PK1细胞中过表达EXT1可显著增强PDCoV、PEDV、SADS-CoV和TGEV感染，且EXT1过表达的HeLa-R19（原本对PDCoV不敏感）细胞感染率显著提升。机制上，EXT1过表达上调了NDST1的mRNA水平，提示其通过协同增强HS硫化修饰促进病毒吸附。
讨论与展望
本研究首次系统揭示HS生物合成通路（SLC35B2-EXT1-NDST1）是多种猪肠道冠状病毒入侵的共有枢纽，为开发以宿主HS为靶点的广谱抗病毒策略（如米托蒽醌衍生药物）提供了理论依据。未来需进一步解析HS与病毒刺突蛋白互作的结构基础，并优化HS靶向药物的特异性与安全性。
