《Autophagy》：NK cell-derived GZMB (granzyme B) suppresses glioblastoma radioresistance by blocking SDC1-mediated autophagosome maturation
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本研究揭示了自然杀伤（NK）细胞在胶质母细胞瘤（GBM）放疗中的关键作用。研究发现，放疗可刺激肿瘤微环境（TME）中细胞毒性NK细胞亚群（ITGAM+CD27-）浸润，其分泌的颗粒酶B（GZMB）是关键的放射增敏效应分子。机制上，GZMB通过识别并切割自噬关键调控蛋白多配体聚糖1（SDC1）的缬氨酸225（Val225）和天冬氨酸228（Asp228）位点，阻碍了转谷氨酰胺酶2（TGM2）向溶酶体的转位，从而抑制了自噬体与溶酶体的融合（即自噬体成熟过程），最终增强了GBM对电离辐射（IR）的敏感性。该研究为联合放疗与NK细胞免疫疗法治疗放射性GBM提供了新的策略和理论依据。
引言：探索胶质母细胞瘤放疗抵抗与免疫治疗联合的新策略
胶质母细胞瘤（GBM）是最具侵袭性的弥漫性胶质瘤，即使经过手术切除、放疗和化疗，患者的中位总生存期仍然很低。放疗是GBM联合治疗中的基本步骤，但肿瘤的放射抵抗性限制了其疗效。近年来，放疗与免疫治疗的联合在多种实体瘤中显示出临床益处，这为探索免疫治疗作为GBM的放射增敏策略而非单纯的肿瘤杀伤手段提供了新视角。自然杀伤（NK）细胞作为先天免疫细胞，具有不依赖主要组织相容性复合体（MHC）的细胞毒性，在联合放疗时展现出强大的靶向癌细胞杀伤能力，但其在GBM治疗中的潜力尚未完全实现。颗粒酶B（GZMB）是NK细胞主要的细胞毒性颗粒之一，除了诱导经典的凋亡途径外，越来越多的证据表明GZMB可能通过直接蛋白酶解作用调节非细胞毒性的生物学过程。自噬（autophagy）是细胞应对辐射等压力的一种适应性反应，其激活与肿瘤细胞的放射抵抗有关。本研究旨在探讨NK细胞及其效应分子GZMB是否能够通过调节自噬过程来影响GBM的放射敏感性。
结果
NK细胞浸润增强GBM对电离辐射诱导的细胞死亡易感性
研究首先利用人GBM细胞系（U251, T98G）与人NK细胞系（YT）的共培养体系，发现尽管NK细胞本身具有细胞毒性，但与YT细胞共培养显著增强了GBM细胞对电离辐射（IR）的损伤反应。在荷瘤小鼠模型（皮下和原位移植瘤）中，NK细胞的过继转移与放疗联合产生了协同抗肿瘤效应，显著延迟了肿瘤生长并延长了小鼠生存期。相反，在药物耗竭小鼠体内NK细胞后，放疗诱导的肿瘤生长延迟效应被严重削弱。重要的是，研究发现IR能够选择性地促进细胞毒性NK细胞亚群（ITGAM+CD27-）在肿瘤微环境（TME）中浸润，但并不直接增强NK细胞对GBM细胞的识别和杀伤（通过LAMP1表面表达评估）。这表明联合治疗的协同效应主要归因于NK细胞介导的放射增敏作用。
NK细胞分泌的GZMB是提升GBM放射敏感性的关键效应分子
鉴于细胞毒性NK亚群的特征是分泌强效毒素，特别是丝氨酸蛋白酶GZMB，研究进一步探究了GZMB的作用。使用GZMB活性特异性抑制剂（Z-AAD-CMK）预处理NK细胞后，其介导的放射增敏效应显著减弱。相反，将纯化的GZMB与外源性穿孔素1（PRF1）共同作用于GBM细胞，或在荷瘤小鼠中给予外源性GZMB，均能显著增强放疗的疗效。这些结果确定NK细胞分泌的GZMB是诱导GBM放射增敏的关键效应分子。
GZMB通过切割SDC1消除其介导的放射抵抗并阻碍自噬体成熟
为了阐明GZMB的放射增敏机制，研究人员对经PRF1±GZMB处理的GBM细胞进行了RNA测序（RNA-seq）。分析发现，自噬相关基因，包括微管相关蛋白1轻链3（MAP1LC3/LC3）和多配体聚糖1（SDC1），在GZMB处理后发生显著变化，且自噬通路显著富集。作为丝氨酸蛋白酶，GZMB通过识别和切割特定底物发挥作用。通过生物信息学分析，研究人员在SDC1氨基酸序列的第225-228位发现了GZMB偏好的底物序列（Val-Glu-Pro-Asp）。功能实验证实，GZMB的放射增敏作用依赖于SDC1的存在。在SDC1敲低的GBM细胞中，GZMB无法增强放射敏感性；而在SDC1过表达的细胞中，GZMB的增敏效果更为显著。
进一步机制研究表明，GZMB能够阻碍IR诱导的自噬体成熟过程。具体表现为：在野生型（WT）GBM细胞中，GZMB处理导致LC3-II/I比值升高和sequestosome 1（SQSTM1/p62）蛋白沉积，提示自噬流被阻断；电子显微镜（TEM）观察发现GZMB显著减少了IR诱导的自噬溶酶体形成；免疫荧光显示溶酶体标志物LAMP2与自噬体标志物LC3的共定位在GZMB处理后显著降低。此外，共免疫沉淀（Co-IP）实验证明，GZMB处理或SDC1敲低均会损害介导自噬体-溶酶体融合的关键SNARE复合物（STX17-SNAP29-VAMP8）的形成。这些结果共同表明，GZMB通过靶向SDC1，抑制了自噬体的成熟。
GZMB特异性识别并切割SDC1的Val225和Asp228位点
研究人员通过免疫印迹验证，无论是与NK细胞（YT, NK-92）共培养还是使用纯化的人GZMB处理，都能在IR后的GBM细胞中产生相同大小的SDC1切割片段，且该切割发生在细胞质内的SDC1上。为了精确定位切割位点，研究人员构建了表达Flag标签的野生型SDC1及其点突变体（V225A, E226A, P227A, D228A）的慢病毒载体。结果显示，SDC1的Val225或Asp228突变为丙氨酸（Ala）后，能够抵抗GZMB的切割。邻近连接实验（PLA）进一步直观地证实了GZMB与野生型SDC1的直接相互作用，而这种相互作用在Val225或Asp228突变体表达的细胞中大幅减少。相应地，在表达这些不可切割突变体（mSDC1V225A, mSDC1D228A）的GBM细胞中，GZMB介导的自噬体成熟阻滞和放射增敏效应均被部分削弱。
SDC1切割阻碍TGM2向溶酶体转位
根据先前的研究，SDC1在辐射后携带转谷氨酰胺酶2（TGM2）转位至溶酶体表面，TGM2则作为关键的“拴系”因子，促进自噬体与溶酶体的结合。本研究证实，GZMB切割SDC1虽然不影响TGM2与SDC1片段的结合，但却阻断了TGM2与LC3的直接相互作用。免疫荧光染色显示，在表达野生型SDC1的细胞中，GZMB处理阻碍了TGM2在溶酶体（LAMP2阳性）和自噬体（LC3阳性）上的定位；而在表达不可切割SDC1突变体的细胞中，TGM2的定位不受GZMB影响。这表明GZMB通过切割SDC1，破坏了TGM2依赖的溶酶体-自噬体栓系，最终导致自噬体成熟受阻。
SDC1的Val225和Asp228位点突变削弱放疗与GZMB激活剂的协同抗肿瘤效果
通过对癌症基因组图谱（TCGA）数据库的分析，发现SDC1的Val225突变存在于GBM患者中。在一项对86例接受术后放疗的GBM患者的回顾性研究中，鉴定出3例患者（约3.5%）存在SDC1的Val225或Asp228突变。与携带野生型SDC1的患者相比，这些突变患者在放疗后三个月显示出较差的肿瘤反应和相对较短的总生存期（OS）。
为了在体内验证其功能，研究人员构建了表达野生型SDC1、mSDC1V225A或mSDC1D228A的GBM皮下移植瘤模型，并分别给予放疗、GZMB激活剂（BTCA）或两者联合治疗。结果显示，在野生型SDC1肿瘤中，BTCA与放疗联合产生了显著的协同抗肿瘤效应；然而，在mSDC1V225A或mSDC1D228A肿瘤中，不仅放疗本身的疗效减弱，BTCA也无法再增强肿瘤对放疗的反应。免疫组织化学（IHC）分析表明，只有在野生型SDC1肿瘤中，GZMB的激活才能有效阻断IR诱导的自噬过程（表现为LC3和SQSTM1沉积增加）；而在突变体肿瘤中，自噬流维持在高水平且不受GZMB水平影响。免疫印迹结果直接证实，只有在野生型SDC1肿瘤中，联合治疗才能检测到SDC1的切割片段。
讨论
本研究揭示了NK细胞来源的GZMB在GBM放疗中的一个新颖功能：通过切割自噬促进蛋白SDC1，阻断自噬体成熟，从而发挥放射增敏作用。该作用依赖于GZMB对SDC1上Val225和Asp228位点的特异性识别和切割。切割后的SDC1无法有效携带TGM2转位至溶酶体表面，进而破坏了自噬体与溶酶体的融合过程。这项研究不仅阐明了GZMB作为一种新型自噬抑制剂的作用机制，也为联合放疗与NK细胞免疫疗法治疗GBM提供了理论依据。此外，研究指出SDC1的Val225和Asp228突变是GBM中存在的癌症突变，可能导致患者对放疗反应不佳，提示检测SDC1突变状态可能作为GZMB相关癌症免疫放疗的有价值的生物标志物。研究结果还表明，放疗能够促进细胞毒性NK细胞在GBM肿瘤微环境中的浸润，而GZMB又能克服GBM中SDC1依赖性自噬对NK细胞杀伤活性的潜在抑制作用，这为克服NK细胞在实体瘤治疗中面临的两个主要障碍（肿瘤浸润不足和效应功能持久性差）提供了新的思路。
材料与方法
本研究使用了人GBM细胞系（U251, T98G）、小鼠GBM细胞系（GL261）以及人NK细胞系（YT-Indy, NK-92）。通过细胞共培养、克隆形成实验、流式细胞术、蛋白质印迹、免疫共沉淀、免疫荧光、透射电镜、邻近连接实验、RNA测序等多种体外实验方法验证了GZMB-SDC1通路的功能。通过构建皮下及原位荷瘤小鼠模型，并利用小动物MRI、免疫组化等技术，在体内水平证实了NK细胞/GZMB的放射增敏作用及其机制。此外，还通过回顾性临床研究和肿瘤基因组数据库分析，探讨了SDC1突变与GBM患者放疗疗效及预后的相关性。统计学分析采用Student's t检验、单因素或双因素方差分析（ANOVA）等方法。
