《Fishes》：Differential Activation of Their Cognate Receptors by NPFF and GnIH Peptides in the Half-Smooth Tongue Sole (Cynoglossus semilaevis)
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本研究首次在比目鱼纲半滑舌鳎中克隆鉴定了NPFFR2-1和NPFFR2-2受体，通过体外功能实验揭示NPFF与GnIH肽类可通过PKA、PKC和Ca2+信号通路交叉激活三种GPCR受体（GnIHR/NPFFR1、NPFFR2-1/2），为阐明神经肽调控鱼类生殖的分子机制提供新证据。
引言
神经肽FF（NPFF）作为RF酰胺肽家族成员，与促性腺激素抑制激素（GnIH）具有同源性。NPFF前体可编码NPFF和NPAF两种成熟肽，二者均具有C端保守的PQRFa motif。现有研究表明，NPFF通过其受体NPFFR2（又称GPR74）参与哺乳动物心血管调节、疼痛感知及应激反应等生理过程，而GnIH则通过GnIHR（即NPFFR1或GPR147）调控脊椎动物生殖活动。尽管NPFF在鱼类生殖调节中具有潜在作用，但其信号转导机制及与GnIH系统的受体交叉反应性在硬骨鱼类中仍不明确。半滑舌鳎作为中国重要经济海水养殖鱼种，其雌性生长优势显著但雌雄比例偏低，且存在性逆转现象，是研究神经肽调控生殖机制的理想模型。本研究旨在解析半滑舌鳎NPFFR2受体的分子特征、组织分布及其介导的细胞内信号通路，并探讨NPFF与GnIH肽类的受体交叉激活机制。
材料与方法
通过RT-PCR技术从半滑舌鳎脑组织克隆npffr2-1和npffr2-2基因编码区，采用实时荧光定量PCR分析其组织表达谱。合成NPFF、NPAF、GnIH1和GnIH2四种C端酰胺化肽段，构建pcDNA3.1-NPFFR2-1/2重组质粒转染COS-7细胞，通过双荧光素酶报告基因系统检测cAMP反应元件（CRE-luc）、血清反应元件（SRE-luc）及核因子激活T细胞反应元件（NFAT-RE-luc）活性。利用毛喉素（FSK）、佛波酯（TPA）作为阳性对照，并采用腺苷酸环化酶抑制剂MDL12330A、PKA抑制剂H89、PLC抑制剂U73122、PKC抑制剂GF109203X、电压敏感钙通道阻滞剂硝苯地平和内质网钙泵抑制剂毒胡萝卜素（TG）进行通路阻断实验。
结果
分子特征与系统进化分析
npffr2-1和npffr2-2的开放阅读框分别为1251 bp和1281 bp，编码416和426个氨基酸的七次跨膜GPCR蛋白。序列比对显示NPFFR2-2与欧洲海鲈、花鲈同源蛋白一致性达88.03–88.50%，与NPFFR2-1一致性为69.85–73.54%。系统进化树表明半滑舌鳎NPFFR2聚类于鱼类NPFFR2分支，与四足动物NPFFR2及GnIHR分支明显分离。
组织分布模式
npffr2-1和npffr2-2转录本在脑和垂体中高表达，在卵巢等外周组织中表达量较低，提示NPFF系统可能通过中枢与外周协同作用调控生理功能。
NPFFR2受体功能特征
在表达NPFFR2-1的COS-7细胞中，NPFF以剂量依赖方式激活CRE-luc和SRE-luc活性，而NPAF仅在100–1000 nM高浓度下显效。NPFFR2-2仅对1000 nM NPFF产生CRE-luc应答，且NPAF可抑制FSK诱导的CRE-luc活性。MDL12330A和H89完全阻断NPFF通过NPFFR2-1/2的CRE-luc激活效应，U73122和GF109203X显著抑制SRE-luc活性。NFAT-RE-luc实验显示，NPFF通过NPFFR2-1微弱抑制活性，而NPAF通过NPFFR2-2显著激活该通路，且硝苯地平与TG可逆转上述效应。
受体交叉反应性
GnIH1/2虽不改变NPFFR2-1/2的基础CRE-luc活性，但显著抑制FSK诱导的CRE-luc增强效应。在GnIHR表达体系中，仅GnIH2抑制FSK刺激的CRE-luc活性。SRE-luc实验表明，GnIH1/2可通过NPFFR2-1/2激活PKC通路，而NPFF/NPAF亦能通过GnIHR引发SRE-luc应答。四种肽均未显著影响NFAT-RE-luc活性。
讨论
本研究首次在比目鱼纲中鉴定出npffr2基因双拷贝，证实其通过PKA、PKC和Ca2+通路介导信号转导。NPFFR2-1主要偶联Gαs和Gαq蛋白，而NPFFR2-2表现出Gαs/Gαi双向调节特性。受体交叉实验揭示GnIH肽类可通过NPFFR2抑制cAMP积累，NPFF肽类亦能激活GnIHR介导的PKC通路，这种跨系统互作可能形成神经肽调控网络的基础。值得注意的是，半滑舌鳎NPFFR2对配体的应答模式与欧洲海鲈、花鲈等物种存在差异，暗示鱼类NPFF系统功能存在种间特异性。
结论
半滑舌鳎NPFF与GnIH肽类可通过三种受体（GnIHR、NPFFR2-1/2）交叉激活PKA、PKC和Ca2+信号通路，其中NPFFR2-1对NPFF/NPAF均敏感，而NPFFR2-2仅响应NPFF且受NPAF反向调节。该研究为阐明硬骨鱼类神经肽功能多样性提供了分子证据，也为探究NPFF/GnIH系统在鱼类生殖调控中的互作机制奠定基础。
